李文，傅超美，傅舒

附子为毛茛科植物乌头 （Aconitum carmichaeliDebx.）子根的加工品，具有回阳救逆，补火助阳，散寒止痛之功效，主治亡阳虚脱、心阳不足、寒凝疼痛等证，为“回阳救逆第一品药”。现代研究表明附子中含有多种强心的化学成分，如乌头碱、新乌头碱、次乌头碱等，此类双酯型生物碱有具有强心、抗心律失常、镇痛抗炎、免疫调节、抗肿瘤等药理作用，但心脏也是附子毒性的靶器官，乌头碱是附子引起心律失常的重要毒性物质基础，表现出对心肌细胞、中枢神经和肌肉组织的毒性反应[1-4]。甘草为豆科植物甘草（GlycyrrhiauralensisFisch.）、胀果甘草（G.inflataBat.）或光果甘草（G.glabraL.）的根及根茎。具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的功效。

在《景岳全书•本草正•毒草部》中曰：“附子之性急，得甘草而后缓；附子之性毒，得甘草而后解；附子之性走，得甘草而后宜心脾；附子之性散，得甘草而后调营卫”。甘草能解附子之毒早已被多数人认识，但附子-甘草配伍减毒的作用机制众说纷纭，包括化学成分、药效毒性、分子机制、组分配伍胃肠吸收动力学等诸多方面。

组分配伍是中药传统“配伍和合”的继承和发展。传统中药配伍多为饮片配伍，常具有成分繁杂、作用机制不明等不足。张伯礼、王永炎院士提出“组分中药”理论，基于中药配伍理论，通过组分间相互作用研究，理清药味间相互作用关系，并通过多因素、动态药理模型指导辨证施治。组分配伍是遵循“复杂-简单-复杂”研究原则，阐明中药配伍关系的新模式。

《素问》云：“主病之谓君，佐君之谓臣，应臣之谓使”。组分配伍在明确有效成分、作用机制和靶点的基础上，按照中医“君臣佐使”理论进行辩证选药组方入药，既坚持中医药整体观，又充分发挥中药多靶点、多环节、多渠道的综合疗效优势，是系统思维与分析还原法的有机结合。陈竺科研组基于中药复方（雄黄、青黛、丹参）的有效组成，将其主要成分四硫化四砷、靛玉红、丹参酮IIA，按照分子配伍理论组方，有效缓解急性早幼粒细胞性白血病，成为现代中药治疗重大疾病的标杆。其中四硫化四砷作“君药”，它直接作用于癌蛋白，通过诱导其降解，从根本上逆转癌细胞的疯长，使其分化成熟；丹参酮和靛玉红作为“臣药”，促进白血病细胞的分化成熟，抑制癌细胞的细胞周期及分裂增殖；并且丹参酮和靛玉红通过增加负责运输硫化砷的蛋白的基因表达，促使硫化砷更多进入细胞，起到了“佐使药”的作用。国际主流科学界对这一研究成果给予积极评价，《Nature》杂志发表了题为“中医药：古老复方的现代新解”的述评。此外，谢恬科研组基于榄香烯三种构型（β-，γ-，δ-榄香烯）的药效机制，结合组分配伍理论，以具有显著杀肿瘤细胞作用的β-榄香烯作为“君药”，γ-，δ-榄香烯可显著增强β-榄香烯抗肿瘤作用，为“臣药”，辅以适宜辅料将其组方研发成为榄香烯抗癌新药，具有减毒增效的制剂优势。

本文将对近年来附子配伍甘草对大鼠心肌细胞减毒作用机制进行综述，以期为中药复方配伍减毒研究提供参考，为中药临床合理应用提供指导。

1 附子对心肌细胞的毒性

1.1 乌头碱对心肌细胞内电生理的影响

中药有多成分、多靶点、弱效应的特点，学者们常常选择其主要有效成分作为研究对象来阐释药物作用机理。附子中主要成分乌头碱是引起心律失常的重要毒性物质基础，所以研究中常常采用乌头碱作为代表研究附子的心肌细胞毒性。心肌细胞膜上有多种离子通道，离子通道是一类跨膜糖蛋白，如Na+、K+、Ca2+、Cl-通道等, 这些离子通道节律性的开放和关闭，通过正常表达与功能的彼此平衡来维持心脏的正常功能。Na+、K+、Ca2+、Cl-等离子流参与了心肌动作电位的形成，任何离子通道电流发生异常，均可导致心肌细胞电生理功能的改变，严重的可致心律失常。

附子中的主要有效成分乌头碱的心脏毒性与心肌细胞内Ca2+和Na+浓度及相关离子泵、ATP酶相关。王茁伉等[6]给予SD乳鼠心肌细胞乌头碱，应用试剂盒检测心肌细胞内Na+、K+、Ca2+的离子含量，以及Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活力，结果15min后细胞内Na+和Ca2+含量增加，而K+含量减少，具有剂量依赖性，同时抑制细胞Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活性。通过测四噻唑兰MTT（OD570-655）的值判断心肌细胞的活力，结果显示，乌头碱可以导致心肌细胞活力的降低，呈现出明显的剂量依赖性。

Fu等[7]研究发现乌头碱能引起大鼠心肌细胞毒性，表现在心肌细胞内Ca2+的浓度有显著性异常，能被Ca2+抑制剂拮抗，故认为附子心脏毒性的主要机制是Ca2+转运失调和细胞内的电耦联障碍导致了心律失常。进一步研究表明，乌头碱可破坏心肌细胞超微结构和细胞膜稳定性，使能量代谢紊乱，影响到细胞膜的Ca2+-ATP酶活性，细胞外的钙离子可经电压门控式L型Ca2+通道（L-type Ca2+channel，LTCC）迅速释放到心肌细胞内，当细胞质中的Ca2+达到了一定的浓度，RyR2通道开放，使细胞内Ca2+超载[8]。另有研究[9,10]结果显示乌头碱作用于心肌细胞后的RyR2基因转录水平和蛋白表达水平上调，可使L型Ca2+通道mRNA的表达增多，使L型Ca2+通道开放数量增加而导致细胞内Ca2+增加，发生钙超载致心律失常。付敏等[11]发现应用乌头碱后，心肌细胞内钙振荡的振幅明显减小，且高浓度乌头碱较低浓度乌头碱致心肌细胞钙振荡振幅的变化更加明显。由此可见乌头碱对心肌细胞内钙信号产生了影响，破坏了钙稳态的平衡，导致Ca2+平衡失调，这可能是影响心肌细胞收缩-舒张功能的主要依据，从而引发心率失常。

张世忠等[12]利用心肌细胞K+通道电生理原理激动钾通道可加强复极,抑制钠通道激活造成的后除极化，结果表明，通过激动敏感的K+通道，显著增高了心肌细胞对乌头碱可耐受的最大浓度，使乌头碱强心效果明显增强，强心作用的有效浓度范围显著增高。还有研究[13,14]发现对心脏的毒性作用机制主要在于抑制心肌细胞质膜Na+通道的失活，使Na+持续内流，延长心肌细胞膜除极化时程而引发心律失常。

1.2 次乌头碱对蛋白表达的影响

次乌头碱也是附子中主要的双酯型生物碱之一，对小鼠的LD50低于乌头碱和新乌头碱，在炮制和煎煮的过程中分解缓慢不易破坏，含量较高[15-17]，故有学者研究次乌头碱对心肌细胞的毒性机理。易明晶[18]用蛋白印迹法和荧光定量聚合酶链式反应法（PCR），研究了附子主要有效成分次乌头碱合甘草苷配伍前后对心肌细胞和心肌组织中钙调控蛋白信使核苷酸（CaM mRNA）和蛋白表达的影响，次乌头碱能够抑制CaM的表达，和连接蛋白43（Cx43）磷酸化水平，从而影响心肌收缩功能和节律变化。

另有研究[19,20]将次乌头碱作用于心肌细胞，观察心肌细胞搏动频率，结果使心肌细胞的波动频率加快，细胞膜稳定性破坏，当次乌头碱浓度超过32μmol﹒L-1时，会使心肌细胞停止搏动。用MTT法检测次乌头碱对心肌细胞的毒性，结果显示次乌头碱对心肌细胞存活率无影响。利用荧光定量PCR测细胞的蛋白表达，表明次乌头碱灌胃给药后能显著抑制钠钙交换体（NCX） mRNA的表达细胞内和诱导Ⅱ型雷诺定受体（RyR2）mRNA的表达，从而导致细胞内Ca2+浓度升高，加重心律失常发生。

1.3 附子毒性与心肌细胞作用靶标的相关性

研究中药发挥药效的活性成分及作用靶点一直是中药研究的巨大挑战和未来方向[21]。近年来，钠钙交换蛋白（NCX）成为研究心肌细胞保护，治疗心律失常的新靶点，心肌舒张时，将胞浆Ca2+转运至细胞外的最主要途径。在病理状态下，胞内浓度升高，显著影响肌浆网的钙填充，诱发自发性的钙释放[22]。

李勇志等[22]通过观察次乌头碱对大鼠心肌细胞Na+通道SCN5A亚基和钠钙交换蛋白（NCX）mRNA表达，得出结论当次乌头碱浓度大于60μmol﹒L-1时，可以通过增加心肌细胞膜里Na+通道SCN5A亚基和NCX mRNA表达，进而激活L-Ca通道后参与心律失常发生过程，所以在干预这两个靶点可以达到减毒而缓解心律失常。Li等[24]建立了高表达 VEGFR的 HEK293 细胞膜色谱[25]在线液相色谱-质谱联用筛选系统，发现作用于 VEGFR-2 的三个活性组分乌头碱、新乌头碱和次乌头碱，并采用体外MTT和ELISA实验验证了对VEGF的抑制作用。

2 附子配伍甘草对心肌细胞减毒作用机制

2.1 附子配伍甘草物质基础

甘草中含有三萜皂苷类成分甘草酸和甘草次酸，黄酮类成分甘草苷，研究表明，甘草主要有效成分甘草苷和甘草酸对心脏具有一定的保护作用，这两类化合物的抗氧化[26]和抗炎作用[27]可能是保护心脏免受伤害的主要机制。而甘草次酸具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节等广泛活性[28]。

有关文献报道[29]，甘草皂苷抗心律失常作用可能是其具有负性频率和传导作用，以及抗心肌缺血作用的结果。附子与炙甘草合煎后，附子乌头碱和炙甘草黄酮类成分的量均有不同程度下降,由此推测甘草抑制附子毒性的物质基础可能与甘草黄酮有关[30]。目前认为“成分结合”学说[31]是附子-甘草配伍减毒主要作用途径，即附子-甘草配伍合煎过程中甘草酸成分与乌头碱等毒性成分根据酸碱成分相互作用结合而逐渐沉淀，使汤液中毒性成分双酯型生物碱含量减少，从而使合煎液毒性降低。从药动学角度看，甘草附子配伍的物质基础可能与其体外化学成分含量无关，而是乌头碱与甘草次酸在体内发生结合反应，生成沉淀生成不溶于水的大分子络合物，降低药液中生物碱量，延缓了其在胃肠道的吸收，从而发挥解毒作用[32-35]。有研究表明[36]附子配伍甘草的比例也会影响作用效果，附子、甘草中主要有效成分次乌头碱配伍甘草次酸对心肌细胞缺氧缺糖损伤有保护作用，其中以1:1配伍组效果最佳。甘草配伍附子对慢性心衰大鼠具有增效减毒的作用，其机制可能跟心肌细胞凋亡信号通路有关。

2.2 甘草配伍附子后对心肌细胞内电生理的作用

周天梅[37]等运用MTT法检测附子-甘草主要有效成分配伍后对心肌细胞存活率的影响，采用Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和琥珀酸脱氢酶（SDH）试剂盒测试。结果表明乌头碱能导致心肌细胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和SDH活性降低，细胞存活率也下降。甘草主要有效成分配伍后，这三种酶的活性和细胞存活率具有一定程度恢复，从而保护心肌细胞损伤。其减毒机理可能是通过SDH、Na+-K+-ATP酶，Ca2+-Mg2+-ATP酶等能量代谢调节，从而抑制心肌细胞缺氧缺血，实现对心肌细胞损伤的保护，发挥减毒作用。

2.2 从代谢角度研究甘草配伍附子减毒机理

Hui Gong等[38]研究发现从甘草中分离出来的异橄榄岩，通过Nrf2激活促进解毒系统，这可能是甘草的潜在保护机制。孙博等[39]利用NMR代谢组学技术对附子、甘草配伍的减毒作用探究，发现是通过对整个代谢环境的调节，减少多种氨基酸、有机酸、酮体等代谢产物受附子毒性影响的含量变化幅度，来有效降低附子的毒性作用。

2.3 次乌头碱配伍甘草次酸和甘草苷的减毒作用

刘巧云等[40]以新生SD乳鼠心肌细胞作为研究对象，观察甘草次酸和甘草苷对次乌头碱引起的心肌细胞形态的变化，以及对超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性的影响，结果表明480μmol﹒L-1甘草苷和120μmo﹒L-1甘草次酸能减小由120μmol﹒L-1次乌头碱所造成的的心肌细胞形态损伤，使心肌细胞SOD和GSH-PX活力增加，降低心肌细胞的凋亡水平，同时提高其抗氧化能力，降低次乌头碱对心肌细胞的毒性

甘草苷与次乌头碱联合作用于乳鼠原代心肌细胞，甘草苷与次乌头碱协同抑制钙调控蛋白的表达，对次乌头碱的心肌连接蛋白43（Cx43）磷酸化的抑制作用产生拮抗，由此在一定程度上拮抗次乌头碱导致的心律失常[18]。

王利勤[36]等研究附子有效成分次乌头碱和甘草成分甘草次酸配伍后对H9c2心肌细胞缺糖缺氧损伤的影响，配伍后细胞形态有明显的改善，同时降低肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（1L-1β）、肌酸激酶（CK）含量及兔抗Caspase-3、Fas-L、Fas蛋白表达，所以甘草次酸和次乌头碱配伍后对心肌细胞缺糖缺氧损伤具有保护作用，其作用机制可能与抑制细胞凋亡和抗炎。

3 结论与讨论

通过以上文献综述，学者们对附子配伍甘草减毒增效机理已经取得了一定的认识，但其研究角度较单一，大多停留在药理毒理作用或物质基础筛选阶段，且研究单一组分的比较多，相互间重复性较大。将来对附子配伍甘草对大鼠心肌细胞的减毒作用机制，可以从以下几点展开进一步研究：①大多数的研究只对乌头碱影响大鼠心肌细胞的的离子变化引发兴奋收缩耦联机制，还未研究乌头碱作用于心肌细胞导致的心率增加的抑制作用是否通过影响心肌细胞离子通道，有待于进一步研究；②研究乌头碱类对心肌细胞受体的影响，现阶段有学者做了对肾上腺素受体的研究，但还未对其他亚型和心肌细胞上的其他受体如M-胆碱受体有所研究。③可以研究附子甘草配伍后的物质变化及体外转运过程研究的还较少，也是研究的一个方向。附子配伍甘草目前仅仅针对正常心肌细胞的研究，可进一步展开对病理状态下心肌细胞的研究。