甄 贞 高学军 张明辉

（1东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030；2农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心，哈尔滨 150030）

转基因生物（GMO，genetically modified organism）是利用基因重组技术引入其他生物或物种的基因而培育出来的生物新品种。转基因技术使农作物获得自身不具有的抗病、抗虫、耐除草剂、抗逆境和高产优质等特性。转基因农作物自1996年商品化以来，种植面积不断扩大，目前全球转基因作物的种植面积已达到2亿多hm2，主要品种为大豆、玉米、棉花、油菜等[1-2]。1996-2016年全球共有30多个国家种植转基因作物，目前我国获批商品化种植的转基因作物只有抗虫棉花、抗病番木瓜，种植面积为2.8亿hm2，其他转基因作物尚未实现商品化种植[3-4]。

转基因作物在商品化种植前均经过安全评价，尚未发现转基因农作物存在安全风险。欧盟委员会历时25年，通过130多项研究得出的结论是：生物技术，特别是转基因技术，并不比传统育种技术危险。世界卫生组织认为，目前尚未显示广大民众使用转基因食品后对人体健康产生了任何影响。但由于食用安全评估的长期性和复杂性，目前也无法定论转基因食品的安全问题，始终争议较大。为了对转基因农作物种植、种子生产与经营、产品加工等环节进行有效管理，保护消费者的知情权和选择权，以及进一步规范农业转基因生物研究、试验等活动，我国已制定了相关法律法规和检测技术标准，由农业部转基因检测专门机构对相关农产品进行检测。

目前国内针对转基因作物种子监管、标识的要求，主要是基于外源DNA分子特征进行定性和定量检测，以及基于外源蛋白特征进行试纸条快速检测。本文对我国主要农作物种子转基因检测方法实际应用情况进行了介绍，包括种子产品抽样、核酸定性、定量检测（通用元件检测、品系特异性检测等）和蛋白检测（试纸条快速检测等）方法。为有关农作物种子生产与经营、产品加工和管理及研发人员提供技术信息。

1 农作物种子产品抽样

在进行农作物种子的转基因检测前需对种子产品进行抽样。通过抽样检测实现从田间作物到农产品终端进行追溯，从而实现农业转基因生物安全监管。目前没有国际范围内可接受的GMO抽样标准。如在加拿大和美国，没有单独的转基因产品抽样标准，欧盟、国际标准化组织（ISO）和中国分别针对GMO的抽样制订了法规标准[5]。我国已发布实施的转基因产品抽样标准有：GB/T 19495.7-2004转基因产品检测取样和制样方法、农业部2031号公告-19-2013转基因植物及其产品成分检测抽样和SN/T 1194-2014植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法[6-7]。农业行政管理部门根据检验性质、相关标准、技术规范或下达任务部门的要求制定详细的抽样计划。根据不同的检验目的，运用适当的统计方法制定抽样计划，确保抽样的合法性和所抽样品的有效性、代表性和原始性。接收样品时应检查并记录样品状态，建立样品的唯一识别系统，进行分类编号；应有专用且适宜的样品贮存环境；对被检方和委托方的样品及有关信息妥善保存和保密。制定的抽样方案应包括以下内容：抽样依据、单位产品的质量特性、产品质量水平、检测等级以及抽样时间、地点和人员。目前国家和各省农业行政主管部门每年进行主要农作物种子的转基因检测监管工作，抽样覆盖了绝大部分种植面积，保障了农作物的种植安全。

抽样是准确检测和进行转基因生物安全监管的先决条件，对检测结果的准确度起到了至关重要的作用。农作物种子抽样方法可以根据具体情况选用简单随机抽样法、系统随机抽样法和分层随机抽样法。抽取样本时需查看样品状况（包装、外观、数量、型号规格、特性与状态、等级、保存要求等），并记录相关信息[8]。

最低样本量的确定必须满足检测方法的极限要求。目前通用的定性PCR方法检测极限一般为0.1%，即1000粒种子中有1粒转基因种子就可以准确检测出来，低于这个含量将不准确。最低抽样量可以用种子粒数表示，根据农业部颁布的标准《NY/T 673-2003转基因植物及其产品检测抽样》规定，一般情况下，农作物种子的最低抽样量需达到1万粒种子，对应种子重量至少大豆1.1kg、玉米1.8kg、水稻0.2kg、油菜0.014kg和棉花0.8kg[9]。在实际操作应用中，一般最低取样量以重量为单位进行抽取。GB/T 19495.7标准规定农作物种子最低检测量为500g，分2个包装。在实际农产品种子转基因检测过程工作中一般要求至少每个样品需有500g。

2 基于外源DNA分子特征进行定性和定量检测

目前国内在农作物种子转基因检测中最常用的是以外源基因的特定DNA序列为对象的PCR检测技术，分为通用元件特异性PCR检测、转化事件特异性PCR检测、品系特异性PCR检测等。通过普通定性PCR或实时荧光定量PCR技术检测转基因转化载体携带的启动子、终止子、标记基因、外源目的基因等特定序列，判断其是否为转基因作物[10-11]。应用有关检测技术标准进行检测时，定性PCR方法检测低限一般为1%，定量PCR方法检测低限一般为0.1%。欧盟规定所有转基因成分含量超过0.9%的食品和饲料都必须进行强制性标识，澳大利亚等国家规定的阈值为1%，韩国、马来西亚等国家为3%，日本等国家规定的标识阈值为5%[12]。中国目前采取的是零容忍的强制性标签制度，没有设定具体的阈值，只要是符合2002年颁布《农业转基因生物标识管理办法》中规定的5类17种转基因产品必须进行标识。

通用元件特异性PCR主要扩增启动子、终止子和遗传标记基因。启动子和终止子包括花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子、玄参花叶病毒FMV35S启动子、根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因NOS启动子、NOS终止子和CaMV35S终止子。遗传标记基因包括膦丝菌素乙酰转移酶基因bar或pat、新霉素磷酸转移酶基因NPTII、潮霉素B磷酸转移酶基因HPT、6-磷酸甘露糖异构酶基因PMI、大肠杆菌中uidA（β-葡萄糖苷酶）基因GUS、绿色荧光蛋白基因GFP等。利用通用元件特异性PCR（执行检测标准：农业部1782号公告-3-2012、农业部1782号公告-6-2012、农业部1782号公告-2-2012、农业部2122号公告-3-2014等），可以初步确定农作物种子是否含有转基因成分。

转化事件特异性PCR用于确定农作物种子含有哪些外源基因成分[2]，用于转入的抗草甘膦、抗虫等外源基因的特定DNA序列，例如检测5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因CP4-EPSPS、Bt杀虫基因Cry1Ac等，以确定样品中是否含有这些外源基因，即样品是否含有相关转基因农作物产品。

品系特异性PCR用于扩增特定转基因农作物品种的特定序列，以确定样品是否属于某种转基因品系。在农作物种子检出通用元件后，通常再利用品系特异性PCR进一步检测该农作物属于何种转基因品系。由于通用元件在自然界可能存在少量的基因漂移，造成农作物种子的转基因假阳性，因此利用品系特异性PCR确定转基因品系才能更准确地确定样品是否含有转基因农作物种子。目前国内常用的农作物种子品系特异性PCR有：转基因大 豆 GTS40-3-2、MON89788、Mon87705、A2704-12、W62等；转 基 因 玉 米 MON810、MON89034、MON88017、TC1507、GA21、Bt10、Bt176、NK603、T25、MIR162等；转基因水稻TT51-1、KF6、KF8、KMD1等；转 基 因 油 菜 GT73、MS1、MS8、RF1、Oxy235等；转基因棉花MON1445/1698、MON15985、MON88913等。通过对这些农产品种子的转基因检测，对国内转基因农作物的非法种植进行有力的追溯和进一步监管。

3 基于外源蛋白特征进行试纸条快速检测

转基因农作物外源目的基因表达的蛋白质可以利用以抗体、抗原为基础的免疫学蛋白质检测方法进行检测。国外如美国Agdia公司已生产销售转基因快速检测试纸条，国内中国农业科学院油料作物研究所等研究单位和有关企业目前也已开发了用于农作物植株和种子的转基因快速检测试纸条，用于快速检测种子或植物叶片等样品中的CP4-EPSPS、Bar、Bt Cry1Ab/1Ac等外源蛋白，以定性检测作物是否为该类转基因产品[12]。

试纸条快速检测法采用双抗体夹心法，试纸条含有偶联了发光基团的外源蛋白的抗体，当外源蛋白存在时会与特异性抗体结合形成复合物，添加二抗后产生特异颜色，进而显示检测结果为阳性。其具有成本低、灵敏度高、特异性强、通用性广和反应速度快、耐储存、易携带等优势。采用试纸条法检测，测定时间15～20min，测试结果准确率高。试纸条法适用于农作物种子在种植、储运以及加工等环节的现场大量样品的初筛检测，可以有效扩大监测范围，降低检测成本[13]。目前国内各省已开始大量推广应用试纸条进行农作物种子的转基因初筛检测工作，显著降低了检测成本和扩大了监测范围，具有良好的应用前景。

4 存在的问题和展望

基于DNA分子特征进行定性和定量PCR检测是目前农作物种子转基因检测中最常用的方法，但目前存在通量较小、操作步骤复杂、周期长、对操作人员的技术要求高、易污染出现假阳性等问题。另外品系特异性的筛查需要逐个测试各个品系是否阳性，工作量很大[14]。PCR检测还需要相应的标准物质，而目前国内外农作物种子转基因检测所需要的标准物质不足，保存周期较短，量值表达方式和形态尚需优化[15-16]。

试纸条法测试只针对某一个外源蛋白，并不是对所有的商业化转基因作物有用。利用试纸条法进行检测，需要采取逐个排除各种外源蛋白的方法来达到检测目的，繁琐、成本高，现有产品还不能完全适用于大批量的农作物检测。基于蛋白的试纸条法也不适合检测经过加工的转基因产品。当转基因作物不含有相应外源蛋白质的时候，也无法采用试纸条法进行检测[17]。

随着转基因农作物新品种的不断研发和产业化，转基因新技术的不断涌现，越来越多的转基因农作物种子将逐步进入市场，农作物转基因检测技术正面临着巨大挑战，需要进行不断的升级进步才能满足市场的需要。自2008年我国实施转基因重大专项以来，转基因检测技术也得到了快速发展[2，18]。国际上也在不断开展新的转基因检测技术的研究，转基因检测日趋多样化、复杂化，研究快速、灵敏、自动化、低成本和高通量的新型检测方法已经成为国内外当今的研究热点和发展方向。已有很多新的转基因技术出现，如环介导等温扩增（LAMP，loop-mediated isothermal amplification）法、数字PCR方法、多重巢式PCR方法、基因芯片法、PCR核酸试纸条法、酶联免疫吸附技术（ELISA，enzyme linked immunosorbent assay）、电化学法、红外光谱法、生物传感器技术（biosensor）、Western blot检测技术、质谱（MS，mass spectrometry）等方法[19-22]。这些新技术的进一步发展完善，以及新型检测方法的不断涌现，将为农作物生产和食品安全提供更好的保障。

[1] James C Global status of commercialized biotech/GM crops：2016[EB/OL].www.isaaa.org/resources/publications/briefs/52/executive summary/defanlt.asp

[2] 王颢潜，陈锐，李夏莹，等．转基因产品成分检测技术研究进展[J]．生物技术通报，2018，34（3）：1-6

[3] 郭慧敏，李涛，王建龙．转基因作物全球发展现状及检测技术研究进展 [J]．食品安全质量检测学报，2017，8（12）：4870-4875

[4] 国际农业生物技术应用服务组织．2016年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势[J]．中国生物工程杂志，2017，37（4）：1-8

[5] Fraiture M A，Herman P，Taverniers I，et al．Current and new approaches in GMO detection ：challengesandsolutions[J]．Biomed Res Int，2015，2015（4）：392872

[6] 曹际娟，张琳，赵禹，等．农产品中转基因检测抽样研究-第1部分：转基因农产品抽样标准国际现状及理论研究[J]．食品安全质量检测学报，2016，7（4）：1497-1503

[7] 徐静，卲筠乔，赵禹，等．农产品中转基因检测抽样研究-第2 部分：从分析样品到试料[J]．食品安全质量检测学报，2016，7（4）：1504-1512

[8] 徐秀渠．农作物种子抽样（扦样）常见问题及防范措施[J]．中国种业，2016（9）：1-3

[9] 杨晓怀，李永红，张森泉，等．转基因成分检测抽制样方法在农业生物安全风险监测方面的应用[J]．安徽农学通报，2016，22（11）：28-32

[10] 陈晓，王朝阳，赵能，等．农作物转基因商业化应用及检测方法综述 [J]．中国种业，2016（7）：18-20

[11] Tsukahara K，Takabatake R，Masubuchi T，et al．Development and evaluation of event-specific quantitative PCR method for genetically modified soybean MON87701 [J]．Shokuhin Eiseigaku Zasshi，2016，57（6）：187-192

[12] 杜智欣，焦悦，张亮亮，等．转基因成分定量检测技术研究进展[J]．食品工业科技，2017，38（10）：379-384

[13] 于波．抗除草剂转基因检测试纸成功推出[J]．基层农技推广，2016（3）：69

[14] 张欣，彭毛，刘波，等．快速试纸条在转基因水稻和大米检测中的应用 [J]．粮食科技与经济，2015，40（5）：48-49

[15] Coello P R，Justo P J，Andrés F M，et al．Comparison of three DNA extraction methods for thedetectionand quantification of GMO in Ecuadorian manufactured food[J]．BMC Res Notes，2017，10（1）：758

[16] Li Z，Li X，Wang C，et al．One novel multiple-target plasmid reference molecule targeting eight genetically modified canola events for genetically modified canoladetection[J]．J Agric Food Chem，2017，65（38）：8489-8500

[17] 徐俊锋，汪小福，陈笑芸，等．用于四种主要作物转基因筛查检测的标准质粒分子的构建及应用[J]．农业生物技术学报，2015，23（9）：1167-1177

[18] 何倩．快速检测法测定转基因农产品存在的问题及对策探讨[J]．农民致富之友，2017（8）：12

[19] 李飞武．转基因作物分子检测方法开发及转AgGlpF基因耐盐大豆材料创制[D]．长春：吉林大学，2017

[20] Salisu I B，Shahid A A，Yaqoob A，et al．Molecular approaches for high throughputdetectionand quantification of genetically modified crops：a review [J]．Front Plant Sci，2017，8：1670

[21] Košir A B，Spilsberg B，Holst-Jensen A，et al．Development and interlaboratory assessment of droplet digital PCR assays for multiplex quantification of 15 genetically modified soybean lines[J]．Sci Rep，2017，7（1）：8601

[22] Fraiture M A，Herman P，de Loose M，et al．How can we better detect unauthorized GMOs in food and feed chains? [J]．Trends Biotechnol，2017，35（6）：508-517