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猪弓形虫病研究概况

2018-01-16王从舟王俊锋

养猪 2018年4期
关键词:包囊卵囊弓形虫

王从舟,王俊锋

(1.商城县动物疫病预防控制中心,河南 信阳 465350;2.信阳农林学院牧医工程学院,信阳 464000)

1 概述

弓形虫病是由弓形虫寄生于人和动物引起的疾病。目前已知的弓形虫中间宿主有45种哺乳动物,70余种鸟类和5种爬行动物,终末宿主为猫科动物[1]。弓形虫寄生在动物体内,随粪便排出体外,通过消化道传染。孕妇感染弓形虫后,可通过胎盘直接传染给胎儿,造成胎儿畸形、先天愚、流产、早产死胎等[2]。

近年来,关于猪弓形虫病的报道越来越多,在我国能够自然感染弓形虫的15种动物中,猪的阳性率最高,加之感染猪症状类似猪瘟,多伴有混合感染或继发感染,病死率高,对养猪业造成巨大损失。20世纪70年代猪的无名高热,其最终祸首就是弓形虫。猪群患病后表现为高热稽留(体温40~42℃)、呼吸困难、咳嗽、腹式呼吸;病猪精神沉郁,结膜发绀,皮肤出现紫红色瘀斑,体表淋巴结特别是腹股沟淋巴结明显肿大,身体下部及耳部出现淤血斑或出现较大面积发紫,有的出现肠炎及神经症状;孕母猪发生早产或产出发育不全的仔猪或死胎。死后剖检可见肺、肝、脾、淋巴结、心肌、脑等处均有炎性坏死性变化,显微镜下可见有多形性的滋养体,有的在心、脑、骨骼肌等处有休止期的包囊[3]。

河南省是养猪大省,是我国主要的生猪外调省份,根据温青娜等在2014年对河南省猪弓形虫感染情况进行调查结果发现,18个地市均有弓形虫感染,调查的73个生猪养殖场中有51个猪场弓形虫IgG抗体存在阳性,阳性率高达69.9%;在调查的2 642份血液样品中,672份血液样品的弓形虫IgG抗体呈阳性,阳性率达23.7%。这表明目前河南省猪群弓形虫感染处于一个较高的水平[4]。为加快农村改革发展步伐,信阳市于2009年被河南省委省政府确定为农村改革发展综合试验区,在全市范围内进行农村改革发展综合试验。《信阳农村改革发展综合试验总体方案》中强调要把具有信阳特色的畜禽等支柱产业实现规模化生产、产业化经营,到2020年,使全市畜牧业产值占农业总产值的比重达到60%,使畜牧业真正成为振兴信阳农村经济的支柱产业,成为农民增收的重要途径。信阳作为传统的养猪业大市,2015年全市生猪饲养量660万头,同比增长3.3%,呈现较快增速。结合畜牧产业集群化建设项目,信阳市已形成以畜牧养殖、种猪生产、饲料加工、金融担保为一体的产业集聚区,形成区域性规模养殖和产业化发展的良好格局。然而,由于养殖规模大、密度大、卫生条件差及农民对疾病的防控认识不足,猪弓型虫病的发病率不断上升,大幅制约了养猪业的可持续发展。但是猪弓形虫病发病因素多,继发、混合感染情况复杂,涉及饲养管理等多方面因素,往往给防控带来很大的难度。此外,由于生产上盲目用药,造成极大的副作用和耐药细菌的不断增多,留下严重的药物残留,严重危害消费者健康。本文就从病原学、流行病学、发病症状及病理变化、诊断、防控等角度对猪弓形虫病进行概述。

2 病原学

弓形虫病的病原体只有一个种,即刚地弓形虫(Taxoplasma gondi),它属于真球虫目(Eucoccidiida)、艾美亚目(Eimeriina)、弓形虫属(Toxoplasma),可以分为不同的虫株。

2.1 病原形态

弓形虫在不同的发育阶段有不同的形态。在中间宿主体内有滋养体和包囊发育阶段,在终末宿主体内还有裂殖体、配子体和卵囊等发育阶段。滋养体、包囊和卵囊对中间宿主和终末宿主均具有感染性。

滋养体:又称速殖子,主要发现在急性病例或感染早期的腹水和有核细胞胞浆里。呈弓形、月牙形或香蕉形,一端偏尖,一端偏钝圆。平均大小为4~7 μm×2~4 μm。经姬姆萨氏液染色或瑞氏液染色后,胞浆呈淡蓝色,有颗粒。核呈深蓝色,偏于钝圆的一端。速殖子主要出现在急性病例的腹水中,常可见到游离的(细胞外的)单个虫体;在有核细胞(单核细胞、内皮细胞、淋巴细胞)内可见到正在进行内出芽增殖的虫体;有时在宿主细胞的胞浆里,许多滋养体簇集在一起形成“假囊”。电镜观察可见有极环、类锥体、8~10条棒状体及高尔基体和线粒体等细胞器。

包囊:常发现在慢性病例或无症状病例的脑、骨骼肌、心、肺、肝、肾等组织内。呈卵圆形,有较厚的囊膜,囊内的虫称为慢殖子,数目可由数十个至数千个;包囊的直径为50~60 μm,可在患畜体内长期存在,并随虫体的繁殖而逐渐增大,可大至100 μm。包囊在某些情况下可破裂,虫体从包囊中逸出后进入新的细胞内繁殖,再度形成新的包囊。在机体内脑组织的包囊数可占包囊总数的57.8%~86.4%。

裂殖体:寄生在猫的肠上皮细胞中。成熟的裂殖体呈圆形,直径为12~15 μm,内有4~20个裂殖子。游离的裂殖子大小为 7~10 μm×2.5~3.5 μm,前端尖,后端圆,核呈卵圆形,常位于后端。

配子体:寄生于猫的上皮细胞中。经过数代裂殖生殖后的裂殖子进入另一细胞内变为配子体,配子体有大小两种,大配子体的核致密,较小,含有着色明显的颗粒;小配子体色淡,核疏松,后期分裂形成许多小配子,每个小配子有1对鞭毛。大小配子结合形成合子,由合子形成卵囊。

卵囊:在猫的肠道上皮细胞中形成,破裂后随猫粪便排出。卵囊呈椭圆形,大小为11~14 μm×7~11 μm。孢子化后每个卵囊内有2个孢子囊,每个孢子囊内有4个子孢子。子孢子一端尖,一端钝,其胞浆内含暗蓝色的核,靠近钝端。卵囊无微孔、极粒、斯氏体和外残体,有内残体。

2.2 生活史

弓形虫的全部发育过程需要两个宿主,在终末宿主(猫科中猫属和山猫属)肠内进行球虫型发育,在中间宿主(哺乳类、鸟类等)体内进行肠外期发育。

在中间宿主体内的发育:中间宿主(包括人、猪等多种动物)食入或饮入污染有孢子化卵囊或包囊的食物和水,或滋养体通过口、鼻、咽、呼吸道黏膜和皮肤伤口入侵中间宿主体内后,子孢子、速殖子和慢殖子侵入肠壁,再经淋巴、血液循环扩散至全身各组织器官,入侵有核细胞,在胞浆中以内出芽或二分裂的方式进行繁殖。如果感染的虫株毒力很强,而且宿主又未能产生足够的免疫力,或者由于其他因素的作用,即可引起弓形虫病的急性发作;反之,若虫株毒力弱,宿主又能很快产生免疫力,则弓形虫繁殖受阻,疾病发作得缓慢,或称为无症状的隐性感染,这时存留的虫体就会在宿主的一些脏器组织(尤其是脑组织)中形成包囊型虫体。当机体免疫力下降时,组织内的包囊可破裂,释放慢殖子,进入血液循环系统或其他新的组织细胞形成包囊或假包囊继续发育繁殖。包囊有较强的抵抗力,能存活数月至数年或更长。

在终末宿主体内的发育:猫吞食了弓形虫的包囊、假包囊或卵囊后,大部分子孢子、速殖子或慢殖子侵入小肠的上皮细胞,进行球虫型的发育和繁殖,经裂殖生殖和配子生殖最后产生卵囊。卵囊随猫的粪便排到外界,在适宜的环境条件下,经2~4 d,经孢子生殖发育为感染性卵囊。也有一部分子孢子、速殖子或慢殖子侵入肠壁,进入淋巴、血液循环,随之被带到全身各脏器和组织,侵入有核细胞内进行无性增殖(又称弓形虫型增殖),最后形成包囊。因此,猫科动物是弓形虫的终末宿主,同时也是中间宿主。通常猫吞食包囊4~10 d就能排出卵囊,而吞食假包囊或卵囊后约需20 d以上。受感染的猫一般每天排出10万~100万个卵囊,排卵囊可持续10~20 d。

3 流行病学

本病分布于全世界,造成广泛流行的因素很多,其生活史各阶段皆有感染性。感染方式多样,除经口和损伤的皮肤、黏膜感染外,还可经胎盘感染。中间宿主广泛,140余种哺乳动物易感;除终末宿主与中间宿主互相交替进行感染传播外,也可在中间宿主之间、终末宿主之间相互传播。包囊可长期生存在中间宿主组织内;卵囊排放量大,且对环境抵抗力也较大,对酸、碱、消毒剂均有相当强的抵抗力,室温下可生存3~18个月,在自然界常温、常湿条件下可存活1~1.5年。

弓形虫病动物感染十分普遍,但大多数为隐性感染。食肉的哺乳动物主要是吃到另一动物体内的虫体而感染;草食动物主要是吃到被卵囊污染的饲料和饮水及含虫的生肉屑(泔水)而感染。猪则两类感染方式兼有。猪、牛、羊等哺乳动物及人均可发生胎内感染。在畜禽中,猪对弓形虫最敏感,从哺乳仔猪到成年母猪均可感染发病,但对哺乳仔猪、小架子猪和怀孕母猪危害最严重。对规模化养猪场的育种母猪、肥育猪和保育仔猪的血清学调查结果显示,育种母猪、肥育猪、保育仔猪阳性率分别为42.4%、22.6%、12.5%。经统计学分析,育种母猪、肥育猪和保育仔猪的弓形虫感染率存在显著性差异,育种母猪的感染率显著高于肥育猪;而肥育猪和保育仔猪的弓形虫感染率虽然没有统计学差异,但肥育猪的血清弓形虫抗体阳性率高于保育仔猪。而对于不同季节河南省猪群的弓形虫感染率研究显示,秋季的猪群感染率最高,经统计学分析显著高于春、夏、冬3个季节,春、夏、冬3个季节的弓形虫猪群感染率之间无显著性差异。

4 发病症状及病理变化

感染弓形虫后是否发病取决于虫株毒力、感染数量、感染途径及宿主的抵抗力等。引起发病的直接原因是虫体毒素的直接作用、有毒分泌物引起的变态反应以及虫体繁殖时大量破坏细胞的综合作用所致。

猪弓形虫病的症状与猪流感、猪瘟相似:病猪精神沉郁,食欲减退,严重时食欲废绝,常便秘,后期下痢;头、耳、下腹部有淤血斑或发绀,后肢软弱无力,行走摇晃,喜卧,体温升高至41~42℃,可延续7~10 d;呼吸快,有浆液性或脓性鼻漏,严重时呼吸困难,喘气,犬坐状张口呼吸,甚至口流泡沫窒息死亡。

急性病例主要见于幼畜,出现全身性病变,淋巴结、肝、肺和心脏等器官肿大,并有许多出血点和坏死灶;肠道重度充血,肠黏膜上可见扁豆大小的坏死灶;肠腔和腹腔内有多量渗出物。病理组织学变化为网状内皮细胞和血管结缔组织细胞坏死,有时有炎性细胞浸润,弓形虫的滋养体位于细胞内或细胞外。

慢性病例常见于老龄家畜,可见有各内脏器官的水肿,并有散在的坏死灶。病理组织学变化为明显的网状内皮细胞增生,淋巴结、肾、肝和中枢神经系统等处更为显著,但不易见到虫体。

隐性感染的病理变化主要是在中枢神经系统内见有包囊,有时可见有神经胶质增生性和肉芽肿性脑炎。

5 诊断方法研究进展

弓形虫病的症状、病理变化上虽有一定的特征,但还不足以作为确诊的依据,必须做实验室诊断,查出病原体或其特异性抗体方能确诊。实验室诊断方法如下。

5.1 病原学诊断方法

主要包括直接涂片染色、组织切片染色、动物接种或细胞培养法、卵囊检查法等。这些方法是从病料里查出弓形虫存在最可靠的诊断方法,但缺点是敏感性低,耗时长,容易漏诊。

5.2 凝集试验

主要包括直接凝集试验(DAT)、间接血凝试验(IHAT)、改良凝集试验(MAT)。间接血凝试验主要用于大规模的流行病学调查。Jm Senet等证实IHAT检测IgM抗体更敏感,且比间接免疫荧光试验(IFAT)更能检测低滴度弓形虫抗体。王贝贝等[5]用建立的MAT方法适合于对初筛样本以及临床上疑似弓形虫感染个体的筛查,但该方法费时费力,不宜在基层推广使用。Lorry B等发现MAT可用于畜群血清学检测,且该法可作为检测组织液的良好候选法。

5.3 酶联免疫吸附试验(ELISA检测)

ELISA因为灵敏度高、特异性强等优点已被广泛应用于弓形虫病的诊断。罗才庆等[6]对ELISA和IHAT比较发现,ELISA更适用于猪弓形虫抗体检测。杨亚晓等[7]对临床上常见的金标法、IHAT、ELISA检测对弓形虫IgG抗体的检测效能进行比较分析:ELISA检测弓形虫IgG抗体的敏感性和特异性较高,适合于大规模的弓形虫IgG抗体筛查。在建立方法方面,白昀等[8]初步建立的间接ELISA检测对猪球虫、猪肺炎支原体等7种重要病原的阳性血清呈阴性反应,抗原批间、批内试验变异系数均小于8%,与商品化试剂盒的符合率达到95%左右,可用于猪弓形虫特异性抗体的检测。近年来,不少学者对重组抗原进行了研究,丁邦胜等研究3种重组抗原(rSAG1+rHXGPRT+rAK)混合的间接ELISA检测弓形虫IgM和IgG,与进口ELISA检测总符合率高,敏感性、特异性较高,更经济实惠。Bartromiej等使用5组弓形虫重组嵌合抗原建立酶联免疫吸附试验检测3个不同群体家畜动物(马、猪、羊)血清中的IgG,结果得到所有嵌合抗原具有高特异性(100%),其中最有效的弓形虫病的诊断重组抗原是SAG2-GRA1-ROP1L,可以检测特定的抗体[9]。

5.4 分子生物学诊断

聚合酶链式反应(PCR)是靠体外扩增病原核酸DNA序列而进行病原诊断的技术。任科研等[10]研制的弓形虫PCR检测试剂盒能扩增出弓形虫特异性基因MIC3片段,最低能够检测到10个弓形虫速殖子的DNA,临床应用效果显著。李辉等建立PCR检测弓形虫抗原最低浓度为0.1 ng/mL,PCR检测弓形虫抗原灵敏度高于传统ELISA检测6 000倍,高于ABC-ELISA方法750倍。周永华等[11]建立的弓形虫荧光定量PCR检测弓形虫Yz-1株和Yz-2株均为阳性,且其他常见寄生原虫、寄生虫呈阴性;检测组织样品中,荧光定量PCR方法的检出率明显高于常规PCR方法。

5.5 环介导等温扩增法(LAMP)

LAMP是一种新型的核酸扩增方法。王玉娇等用建立的猪弓形虫病LAMP法检测猪弓形虫病血液样本,在样本DNA稀释3×105倍后仍可检出猪弓形虫DNA,且该方法扩增不出新孢子虫、瑟氏泰勒虫及猪附红细胞体等病原DNA,适合于猪弓形虫病的检测。邹杰等建立的弓形虫LAMP法能够检测出10个拷贝的目的基因,与新孢子虫等近源原虫DNA无交叉反应,且极大地缩短了时间[12]。

6 猪弓形虫病的防治

6.1 中草药防治

杨树森等[13]从120种中草药中筛选出30种具有不同程度干扰弓形虫侵入能力的中药发现,水浸煎剂1∶20稀释时,能使弓形虫侵袭力下降60%以上的药物有:甘草、柏子仁、牛膝、鸡冠花、女贞子、续断、淫羊藿,其中甘草的抑制率达到了100%。其他中药提取物如青蒿素、扁桃酸、蒿甲醚、青蒿琥酯、大蒜素等均可对试验动物有保护作用。还有一些复方制剂对弓形虫病有较好疗效,如扶正去原汤(基础药方:黄芪、青蒿、厚朴、苦参、生山楂)、清酒冲剂(基础药方:红藤、丹参、白花蛇舌草、王不留行、车前子、黄柏、知母、柴胡、制大黄、丹皮)等[14]。

6.2 抗生素防治

目前在众多抗生素药物中,仅阿奇霉素对弓形虫包囊有较好疗效,主要表现在剂量小、吸收好、高浓度集中于有核细胞中、缓慢释放和靶向效应等,通过白细胞和吞噬细胞转运到炎症部位,组织中药物浓度比血清中高10倍之多。Degerli等应用小鼠模型研究阿奇霉素抗弓形虫效果,结果显示200 mg/kg的阿奇霉素具有预防作用,250 mg/kg的阿奇霉素具有治疗作用。此外,大环内酯类抗生素中的螺旋霉素和罗红霉素对弓形虫也有一定的治疗效果,其中螺旋霉素主要用于治疗妊娠期获得性急性弓形虫病。在其他类型抗生素中,Araujo应用小鼠急性和慢性弓形虫病模型发现,林可霉素对弓形虫病有治疗作用,而且对先天性弓形虫感染具有预防作用。一般临床中,猪弓形虫病的经典传统治疗药物以乙胺嘧啶和磺胺类药物联合应用为主。控制症状效果明显,但复发率高,有一定的毒副作用,如乙胺嘧啶的血液毒性及磺胺类药物的骨髓抑制、白细胞减少症、血小板减少症、皮疹等,免疫系统损伤时磺胺类药物会产生更高的毒性[15]。

6.3 其他类型药物防治

其他应用于治疗猪弓形虫病的药物主要有免疫抑制药、安定药、氯喹等。免疫抑制药主要有甾醇类免疫抑制药硫唑嘌呤(AZA),为二氢叶酸还原酶的抑制剂。对于真菌和原虫,能抑制甲基固醇转移酶,可能具有抗弓形虫活性。Jones等研究12种常用安定药和情绪稳定药阻止弓形虫繁殖效力,试验证实了安定药可能成为治疗弓形虫病的新候选药物。氯喹为氨基喹啉类抗疟药,是一种非常有效的治疗弓形虫病药物。其治疗机理是破坏弓形虫细胞膜及核膜,降低其攻击有核细胞的能力,阻断其在细胞内的增殖,且造成代谢紊乱。

6.4 疫苗研究进展

6.4.1 虫体特异组分疫苗 这种疫苗是用免疫化学方法从虫体裂解物或排泄物和分泌抗原(Excretedsecreted antigen,ESA)中提取特定组分制备而成。Darcy等用无细胞基制备的弓形虫ESA免疫接种大鼠,可产生高滴度抗体血清,将该血清注入对弓形虫高度敏感的幼龄大鼠,可获得抗RH株的抵抗力,存活期明显延长。随着单克隆抗体技术的发展,该类型疫苗将有更大的发展。

6.4.2 利用弱毒或减毒株作为疫苗 这两类疫苗属于全虫疫苗,其中灭活疫苗对动物进行免疫接种显示,抗感染能力较弱。临床上常用以下3种毒株。Ts-4温度敏感株是1976年由Prefekom等分离出的RH株突变体,在37℃正常生长,高于40℃无法存活,其毒力明显低于RH株且接种后不在体内持续存在。迄今,包括小鼠在内的多种动物都已成功地用无毒、非持续性的弓形虫Ts-4温度敏感变异体活速殖子作为疫苗接种而获得抗致死性攻击的保护。Ts-4疫苗的安全性也在动物试验中得到证实。T-263毒株具有抑制猫体内排出弓形虫卵囊的能力,在切断传播途径方面起重要作用。正常猫接种该疫苗后,既未出现症状,也未排出卵囊,因此比较安全。但该活疫苗具有一定危险性,当机体抵抗力下降时,猫可成为传染源。S48速殖子疫苗接种孕羊后,对照组只有18%羔羊存活,而试验组的羔羊存活率达75%。目前,该疫苗已在一些国家推广应用。

6.4.3 基因工程苗 包括亚单位疫苗和复合多价疫苗。Saaved等以人的T淋巴细胞(TCC32)对弓形虫ROP2蛋白抗原的表位进行识别发现,序列197-216ROP2抗原含有TCC32识别的表位,认为其有可能作为候选疫苗。抗弓形虫全抗原、P30抗原的McAb均对弓形虫具有明显的杀伤作用,能准确识别P30抗原,可应用于弓形虫病亚单位疫苗的研制,是极有前途的候选疫苗分子。尽管基因工程疫苗具有很大的应用潜力和众多的优点,但是此类疫苗生产过程复杂,技术难度大,生产成本高,免疫活性还不理想,从而限制了此类疫苗推广,目前尚无此类疫苗应用人体的报道。

6.4.4 核酸疫苗 核酸疫苗是20世纪90年代发展起来的第3代疫苗。它将编码抗原的基因插入载体质粒中构成重组质粒,直接接种机体,达到抗感染目的。目前弓形虫核酸疫苗的候选分子主要集中在以下几个方面:弓形虫表面膜抗原(SAG)基因、虫体棒状蛋白(ROP)基因以及致密颗粒基因等。弓形虫核酸疫苗的研制尚处于起步阶段,但其将是今后的研究方向[16]。

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