□ 李秋阳 姚 瑶 北京出入境检验检疫局

在PCR指数扩增过程中，借助强弱不同的连续监测荧光信号及时测定异性产物量，将此作为依据，测出目的基因拷贝数。定量PCR技术从产生开始至逐步完善，不再是最初的单一染料法，演变成特异性比较高的Fret、Taq man等探针法，随着Taq man探针广泛使用，这种方法也被称为实时定量PCR的方法。

1 实时荧光定量PCR技术基本原理

PCR反应循环次数越来越多，反应中生成的DNA拷贝数呈指数级增长，且逐步转入平台期，在此期间，实时荧光定量PCR动态检测整体PCR反应流程，不断分析及扩增有关荧光信号，紧随反应动态测出荧光信号变化，通过电脑自动绘制成一条曲线，以检测指数期特定点PCR产物量，经过推断，得出模板最初含量[1]。荧光阈值将PCR反应开始前循环荧光信号前15个用作荧光本底信号，通常超过荧光阈值检测到的荧光信号是一个值得信赖的信号，将其作为定义样本Ct值，也就是在PCR循环时，各反应管中荧光信号至指定阈值过程中需要经历的循环数。从研究情况看，各模板Ct值和该模板起始拷贝数是一种线性的关系，具体来说是一种对数线性关系，起始拷贝数与Ct值呈反比。根据已经得知的起始拷贝数的标准样品便能绘制出标准曲线，所以，仅需要得到未知样品Ct值，便能算出样品的起始拷贝数。

2 食品检验中实时荧光定量PCR技术的应用

2.1 实时荧光定量PCR技术在转基因食品检测中的应用

全球范围内，转基因作物种植面积越来越大。经过批准可用作加工原料的转基因作物有玉米、大豆等。转基因食品在给人们带来经济效益的同时，也让食品营养更多样。而转基因作物存在一定的环境及生态问题，经过加工制成的食品，对人类健康的影响受到人们关注。甲基化检测与SNP检测等基因分型：Realtime PCR一般使用两种方式，一种是探针法（Taq man probe），另外一种是荧光染料掺入法（Sybr green），在PCR反应体系中加入过量SYBR荧光染料，当该染料特异性地掺入DNA双链时，就会发射荧光信号，没有掺入链中的SYBR染料则不发射任何的荧光信号。基因表达差异分析：如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异（如药物处理、物理处理、化学处理），特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证。转基因食品不断增多，需要强化监测及控制工作。转基因产品检测包括下述三点：

（1）明确是否是转基因产品，是否需要进行定性检测；（2）经过鉴定，确定转基因产品品系；（3）监测转基因产品含量[2]。

RQ-PCR技术的应用，较好地满足了转基因产品检测的需求。RQ-PCR技术普遍应用在多种农作物检测当中，如转基因玉米、大豆等，当前转基因作物中具有独特的启动子35S、耐除草剂基因EPSPS，用于确定是否为转基因产品。

2.2 实时荧光定量PCR技术在食物加工过程中外源DNA污染定量中的应用

（1）检测掺假量。因为相比蛋白质，DNA的热稳定性更高，和免疫学检测技术相比，PCR技术应用过程中，无须借助特异性抗体。相比特异性抗体的合成时间，它的制备时间更久，因此，RQ-PCR技术在食品掺假量检测方面是一种不错的选择。SandbergM等人把RQ-PCR技术用于谷物基因定量检测当中，也将缺乏麦麸婴儿食物控制在有效范围。

（2）检测病原微生物。人们十分注重食源性微生物的检测。应用PCR技术能更好地测出病原体。在实验当中，由于受到污染会发生假阳性，所以普通PCR并不用作标准。RQ-PCR灵敏度较高，被推广应用于食源性微生物检测当中，同时，能够定量测定致病菌污染程度。如葡萄中一般存在曲霉菌污染，有一定的毒性，Mule G等人将RQ-PCR技术用于测定葡萄中曲霉菌污染程度。通过此项技术还能够测出朊蛋白基因种特异性DNA序列，这是其他一些技术不能做到的。

3 结束语

PCR技术能够短时间扩增各期单的DNA片断，在实际应用中具有重要价值。传统的PCR容易遭受污染，不能正确定量，而实时荧光定量PCR技术具有较好的特异性、灵敏度，能够快速反应。RTQ-PCR技术逐步优化，它为食品行业提供了重要的检测工具。相信随着科学技术的发展，未来实时荧光定量PCR技术将更加成熟，能够较好保证食品检验的科学性及准确性。

[1]吴永彬,肖维威,马文丽.实时荧光定量PCR技术在转基因食品检测领域中的应用[J].生物技术通讯,2011,22(4):575-579.

[2]沈赟.实时荧光定量PCR技术在食品检验中的应用[J].江苏预防医学,2006,17(4):85-86.