张华林 李梦璐 黄 金 王凯戎 马海绒

（宁夏医科大学口腔医学院，宁夏银川750004）

电纺PLGA/HA/羊毛角蛋白复合支架的制备及性能研究

张华林 李梦璐 黄 金 王凯戎 马海绒

（宁夏医科大学口腔医学院，宁夏银川750004）

目的 通过高压静电纺丝法制备PLGA/HA/羊毛角蛋白复合支架并对其理化性能、细胞相容性进行表征。方法先将聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）与羟基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）、羊毛角蛋白复合，采用高压静电纺丝法制备PLGA/HA/羊毛角蛋白复合支架，采用扫描电子显微镜（SEM）、红外光谱（FTIR）、万能力学测试机以及细胞培养等分析复合支架的理化性能及细胞相容性。结果 PLGA/HA/羊毛角蛋白复合支架是由长而连续的超细纤维相互交织构成的三维多孔结构，HA、羊毛角蛋白颗粒基本都被包裹于纤维内部；PLGA/HA/羊毛角蛋白复合支架的拉伸强度、断裂伸长率和杨氏模量的平均值分别为4.16MPa、13.96%和135.55MPa；SD大鼠骨髓间充质干细胞在PLGA/MWNTs/羊毛角蛋白复合支架表面生长、增殖良好，HA和羊毛角蛋白的加入有利于细胞的粘附和生长。结论 通过高压静电纺丝法制得的PLGA/HA/羊毛角蛋白复合支架具有良好的表面形貌、力学性能和细胞相容性，在组织工程领域有较大的应用潜力，尤其是作为组织工程的支架用于组织再生。

静电纺丝；PLGA/HA/羊毛角蛋白；复合支架；细胞相容性

严重创伤、肿瘤切除、感染、先天性畸形等所造成骨缺损的治疗是现代医学面临的难题和巨大挑战。目前临床上常用的修复手段有自体骨移植、异体骨移植以及使用人工骨等，但以上方法均存在一定缺陷。因此，有必要寻找一种新的骨缺损的修复手段。

组织工程学的兴起和发展，为弥补目前骨缺损治疗方法的缺陷带来了希望[1]。组织工程支架是骨组织工程的核心环节之一。目前骨组织工程支架材料包括无机材料和有机材料两大类。但由于有机、无机的单一材料都存在一些不足，很难满足理想的骨组织工程支架所要求的特性，所以可以通过合适的方法将几种单一材料复合，形成复合型材料，取长补短，以解决理想的骨支架的问题[2]。高压静电纺丝，是一种利用聚合物溶液或熔体在强电场作用下形成喷射流进行纺丝加工的工艺[3]。由静电纺丝制备出的纳米纤维由于具有小尺寸、大比表面积和特殊的表面与界面效应，从而表现出传统纤维材料所不具备的独特性能。通过静电纺丝技术制备的纳米纤维材料，广泛应用于软骨、骨、皮肤、血管、神经等组织工程和修复再生方面[4-5]。

本研究将合成材料聚乙交酯-丙交酯共聚物（PLGA）、天然成分羊毛角蛋白和无机成分羟基磷灰石（HA）复合在一起形成复合材料，优势互补，通过高压静电纺丝法构建PLGA/HA/羊毛角蛋白复合骨组织工程支架，并对其理化性能、细胞相容性进行表征。

1 材料与方法

1.1 电纺PLGA/HA/羊毛角蛋白复合支架的制备：

将PLGA溶于三氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中，浓度为15%w/v，待PLGA充分溶解后再加入5%w/v的HA以及5%w/v的羊毛角蛋白，室温下搅拌30 min后超声震荡60 min。将纺丝液倒入10 mL注射器中，将注射器与电纺设备相连接进行静电纺丝。

1.2 PLGA/HA/羊毛角蛋白复合支架的表征：用扫描电子显微镜（SEM）观察膜的表面形貌；用傅立叶变换红外光谱仪（FTIR）分析复合膜在4000～500 cm-1区间的红外光谱图；用万能力学测试机测试复合膜的拉伸强度、弹性模量以及断裂伸长率。将复合膜制成10 mm×70 mm的长条形试样进行拉伸测试，每一组试样的数量为5个，拉力机的拉伸速度为5 mm/min。

1.3 骨髓间充质干细胞的分离、培养、接种：骨髓间充质干细胞被置于含5 mL的α-MEM培养基的培养瓶中，将培养瓶置于37℃含5%CO2饱和湿度的培养箱中恒温培养。将消毒后的支架放入6孔板中，第三代细胞经0.25%胰蛋白酶溶液消化后，将浓度为1×105个/mL的细胞悬液常规接种于支架表面，进行SEM观察。

1.4 细胞增殖情况测定：将实验组（PLGA/HA/羊毛角蛋白复合支架、PLGA/HA复合支架）和对照组（纯PLGA支架）的样品置于6孔板内，加入α–MEM培养基，然后将培养的细胞以1×105个/mL的密度接种于放有试样的培养板内，分别在第1，3，5天测定各孔吸光度值，记录结果。

1.5 统计学处理：采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，组间两两比较采用t检验，多组数据间采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

图1纯PLGA支架、PLGA/HA复合支架及PLGA/HA/羊毛角蛋白复合支架的SEM图（3000×）。

2 结果

2.1 PLGA/HA/羊毛角蛋白复合支架的SEM观察：三组都通过静电纺丝的方法成功制备了长而连续的电纺纤维，三组支架均由超细纤维相互交织构成三维多孔结构，与天然的细胞外基质结构相似。纯PLGA支架纤维表面光滑、直径均匀；PLGA/HA复合支架纤维表面略粗糙，纤维局部可以看到团聚的HA颗粒，直径没有纯PLGA纤维均匀；PLGA/HA/羊毛角蛋白复合支架纤维直径明显较纯PLGA纤维小，纤维粗细不均，HA、羊毛角蛋白颗粒基本都被包裹于纤维内部，纤维局部可以看到团聚的HA和羊毛角蛋白颗粒，见图1。

2.2 PLGA/HA/羊毛角蛋白复合支架的红外光谱分析：HA纳米颗粒的红外光谱图显示了在1090cm-1，603cm-1和 566 cm-1处的PO43-吸收峰以及3500 cm-1附近的OH吸收峰。羊毛角蛋白在3424.14 cm-1处为氨基和羧基的伸缩振动峰，在1648.77 cm-1、1539.50 cm-1、1241.60 cm-1处均有强吸收峰，分别为α-螺旋构象的酰胺I谱带、酰胺Ⅱ谱带和酰胺Ⅲ谱带的特征峰，说明羊毛角蛋白中含有大量的α-螺旋型构象，而且含有酰胺键，并且有多肽特征，是以α-螺旋型构象为主的蛋白质。PLGA/HA/羊毛角蛋白复合支架、PLGA/HA复合支架与纯PLGA支架的红外光谱图很相似，并没有出现HA以及羊毛角蛋白的特征峰，分析原因可能是由于复合支架中HA、羊毛角蛋白颗粒含量很少以及二者被包裹于纤维内部的原因，见图2。

图2 红外光谱图

2.3 PLGA/HA/羊毛角蛋白复合支架的力学性能分析：PLGA/HA/羊毛角蛋白复合支架的拉伸强度、断裂伸长率和杨氏模量的平均值分别为4.16 MPa，13.96%和135.55 MPa，表明所制备的PLGA/HA/羊毛角蛋白复合支架具有一定的强度和柔韧性，能够满足支架材料的力学性能要求，详见表1。

表1 PLGA/HA/羊毛角蛋白复合支架、PLGA/HA复合支架以及纯PLGA支架的的力学性能指标 （x±s）

图3 SD大鼠骨髓间充质干细胞的SEM图

2.4 细胞与复合支架共培养SEM观察：培养24h后，在纯PLGA支架表面，粘附细胞数量较少，大部分细胞胞体呈细长梭形，面积较小，表明细胞尚未发生铺展，少部分细胞己经铺展呈多边形。在PLGA/HA/羊毛角蛋白复合支架和PLGA/HA复合支架表面，细胞数量明显较纯PLGA组多，细胞己经开始铺展，呈多突起状借伪足附着于材料表面，见图3。

2.5 细胞的增殖活性：三组细胞的数量都随培养时间的增加而增加。PLGA/HA/羊毛角蛋白复合支架组的细胞数量较PLGA/HA复合支架组多（P＜0.05）。说明实验组细胞增殖的速度和活性明显高于对照组，PLGA/HA/羊毛角蛋白复合支架组高于PLGA/HA复合支架组。这可能是因为实验组加入的HA和羊毛角蛋白增加了复合膜的亲水性和生物活性，因此，也促进了SD大鼠骨髓间充质干细胞早期的粘附和增殖，见图4。

3 讨论

本研究通过高压静电纺丝法制备得到PLGA/HA/羊毛角蛋白复合支架。该复合支架具有良好的表面形貌、力学性能和细胞相容性，在组织工程领域有较大的应用潜力，尤其是作为组织工程的支架用于组织再生。

图4 骨髓间充质干细胞MTT图

［1］ Langer R，Vacanti JP.Tissue Engineering［J］.Science，1993，260（2）：920-926.

［2］ Zhang HL，Chen ZQ.Fabrication and ccharacterization of electrospun PLGA/MWNTs/hydroxyapatite biocomposite scaffolds for bone tissue engineering［J］.Journal of Bioactive and Compatible Polymers，2010，25（2）：241-259.

［3］ 张文.PPV和PPV/PVA电纺纤维的研制与性能研究［D］.沈阳：东北大学，2006.

［4］ Spasova M，Stoilova O，Manolova I，et al.Preparation of PLLA/PEG nanofibers by electrospinning and potential applications ［J］.Journal of Bioactive and Compatible Polymers，2007，22（3）：62-76.

［5］ Piras AM，Chiellini F，Chiellini E，et al.New multicomponent bioerodible electrospun nanofibers for dual-controlled drug release［J］.Journal of Bioactive and Compatible Polymers，2008，23（6）：423-443.

Study on Preparation and Properties of Electrospun PLGA/HA/wool keratin Composite Scaffold

Zhang Hualin Li Menglu Huang Jin Wang Kairong Ma Hairong
（College of Stomatology，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China）

Objective To prepare the PLGA/HA/wool keratin composite scaffold by electrospinningand study its physical and chemical properties and cell biocompatibility.Methods The PLGA/HA/wool keratin composite scaffoldwas prepared by electrospinning；then，SEM，FTIR，universal mechanical testing machine and cell culture were used for characterization.Results The PLGA/HA/wool keratin composite scaffold，composed of long and continuous superfine fibers，had a three-dimensional and porous structure.HA and wool keratin particles were wrapped inside the fibers；SD rat bone marrow mesenchymal stem cells grew well on the surface of PLGA/HA/wool keratin composite scaffold，and the addition of HA and wool keratin was beneficial to cell adhesion and growth.Conclusion The electrospun PLGA/HA/wool keratin composite scaffold has good surface morphology，mechanical properties and biocompatibility，and it may have great potential applications in the field of tissue engineering，especially as a scaffoldfor tissue regeneration.

Electrospinning；PLGA/HA/wool keratin；Composite scaffold；Cell compatibility

R783.1

A 学科分类代码： 32044

1001-8131（2017）06-0501-04

宁夏自然科学基金项目资助N217073；大学生创新实验项目（宁教高（2013）254号）

2017-05-18