周志敏,何群力

(1.新乡医学院基础医学院微生物教研室,新乡 453000; 2.许昌市人民医院，许昌 461000)

肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae,S.pn)是临床较常见的机会性致病菌,定植于鼻咽部。侵袭性肺炎球菌疾病(Invasive pneumococcal disease,IPD)是引起肺炎、菌血症和脑膜炎等的重要菌种,临床检出率约为30%～60%,致死率约为5%～16%,是10岁以下儿童细菌感染死亡的主要原因[1]。随着耐万古霉素和大环内酯类的肺炎链球菌的出现[2-3],给抗生素治疗带来了严峻考验。研究认为[4],菌株的侵袭力和致病力是由遗传和环境2个因素共同决定。不同地区或同一地区不同时期流行的IPD可能不同[5-6]。基于此,本研究旨在分析许昌市人民医院(以下简称我院)分离的IPD流行血清基因型、致病毒力基因、大环内酯类耐药机制及与细菌毒力的关系,为细菌疫苗的研究提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1仪器 Stepone PCR 仪和凝胶图像分析仪(美国ABI公司)；SYDRASYS 2电泳仪(法国Sebia公司)；BSC-1100-1-LIIA2生物安全柜(北京哈东联公司)；HF151UV细菌培养箱(上海力康公司)。

1.2材料 基因组 DNA 提取试剂盒(日本TaKaRa 公司)；PCR扩增体系(美国Sigma 公司)；引物(上海生工生物工程有限公司)。

2 对象与方法

2.1对象 收集2013年6月～2016年6月分离鉴定的侵袭性肺炎链球菌(IPD)共12株，作为观察组,同时收集10株健康志愿者的携带肺炎链球菌作为对照组。采用Phoenix100全自动细菌鉴定/药敏系统(美国BD 公司)进行细菌分离和鉴定。观察组男性7例,女性5例,年龄为6～62岁,中位年龄为12岁。标本来自血液6例,痰液2例,胸水2例,脑脊液2例。对照组男性5例,女性5例,年龄为5～60岁,中位年龄为10岁,标本来自咽拭子。2组性别和年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。该研究取得我院伦理委员会批准及患者、家属的知情同意权。

2.2研究方法 采用多重PCR扩增法进行血清基因型分型,PCR 扩增6个致病毒力基因,包括荚膜(cps2A)、细菌素(bacteriocin)、表面黏附素 A (psa A)、B 组链球菌细胞壁分离蛋白(pcs B)、溶血素(ply)和酪蛋白水解蛋白酶 P(clp P),分析其碱基序列的突变情况；采用 MIC 法测定青霉素、头孢吡肟、左氧氟沙星、红霉素和美罗培南的耐药性和最低抑菌浓度(MIC)值。

2.2.1血清基因型分型 主要步骤：采用C+Y半合成培养基(主要成分有酪蛋白、谷氨酰胺、盐酸半胱氨酸、腺苷、胆碱和酵母等)培养肺炎链球菌菌株至 A620为 0.4～0.5,提取基因组 DNA,多重 PCR法对流行的6种血清型进行分型。引物见表1。反应体系为10×Buffer 5.0 μL+MgCl22.5 μL+d NTP mixture 2.0 μL+上下游引物各1.0 μL+Taq 酶0.4 μL+DNA 模板0.5 μL,加水至总体积25 μL。反应参数为94 ℃,4 min；94 ℃,45 s；54 ℃,45 s；65 ℃,2 min 30 s,共循环 30 次。反应完成后,取 4 μL 产物，用 2.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定目的条带。

表16种血清型的序列引物和长度

Tab.1 Sequence and length of 6 serotypes

血清型引物长度/bp6CF:5'-CATTTTAGTGAAGTTGGCGGTGGAGTT-3'727R:5'-AGCTTCGAAGCCCATACTCTTCAATTA-3'6A/BF:5'-AATTTGTATTTTATTCATGCCTATATCTGG-3'250R:5'-TTAGCGGAGATAATTTAAAATGATGACTA-3'14F:5'-CTTGGCGCAGGTGTCAGAATTCCCTCTAC-3'208R:5'-GCCAAAATACTGACAAAGCTAGAATATAGCC-3'17FF:5'-TTCGTGATGATAATTCCAATGATCAAACAAGAG-3'693R:5'-GATGTAACAAATTTGTAGCGACTAAGGTCTGC-3'19AF:5'-GTTAGTCCTGTTTTAGATTTATTTGGTGATGT-3'478R:5'-GAGCAGTCAATAAGATGAGACGATAGTTAG-3'19FF:5'-GTTAAGATTGCTGATCGATTAATTGATATCC-3'304R:5'-GTAATATGTCTTTAGGGCGTTTATGGCGATAG-3'

2.2.2致病毒力基因检测 根据标准菌株肺炎链球菌 D39设计毒力基因引物序列,反应体系见表2,为5×PS Buffer 10.0 μL+ d NTP mixture 4 μL+上下游引物各1.0 μL+ Primer Star 0.5 μL+ DNA模板1.0 μL，加水至50 μL。反应参数为98 ℃,10 s；53 ℃,30 s；72 ℃,1 min,循环 30 次,72 ℃,10 min。反应完成后,取 3 μL产物，用 1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定目的条带,序列分析采用DNAssist Version 2.2 软件。

表2毒力基因的序列引物和长度

Tab.2 Sequence and length of virulence genes

毒力基因引物长度/bpcps2AF:5'-TTCGCGGGAAGTCTACTAAG-3'1606R:5'-GGGACCGTCATCTACATCAA-3'bacteriocinF:5'-AAGAGTAAGTTCGTTGTT-3'577R:5'-TCTACAGTCTTTCCCATT-3'psaAF:5'-TAATGTTGCGGCAGGTTCT-3'1136R:5'-CGGAAATGTGGGCATAGAA-3'pcsBF:5'-ACGGTAAAACCTGAAAAGAG-3'1305R:5'-AAATGTAACAAAGGCGTAAT-3'plyF:5'-ATGGCAAATAAAGCAGTAAATGACT-3'1415R:5'-CTAGTCATTTTCTACCTTATCCTCT-3'clpPF:5'-AACTCAAAAGGAGAAATG-3'791R:5'-TCTTGGAATGATAGGTAAT-3'

2.2.3药敏试验 质控菌株为肺炎链球菌ATCC49619,采用全自动细菌鉴定/药敏系统进行药敏试验,2013CLSI 肺炎链球菌 MIC 法标准结果分析。

3 结果

3.1血清基因型分型 基因型14、6A/6B和19F在2组中检出率比较差异无统计学意义(P>0.05),19A、6C和17F在观察组中检出率显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

3.2致病毒力基因 观察组6种致病毒力基因检出率均明显高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表4。

3.3药敏试验 观察组对青霉素和红霉素不敏感率显著高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)；2组对头孢吡肟、左氧氟沙星和美罗培南的敏感率比较差异无统计学意义(P>0.05)。观察组对青霉素和红霉素的MIC值显著高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表3血清基因型分型

Tab.3 Classification of serum genotype [例(%)]

表4致病毒力基因

Tab.4 Virulence genes [例(%)]

表5药敏试验检测耐药率和MIC值

Tab.5 Drug sensitivity test detected drug resistance and MIC

组别例数青霉素红霉素头孢吡肟左氧氟沙星美罗培南青霉素MIC/μg·mL-1红霉素MIC/μg·mL-1观察组1211(91.7)10(83.3)2(16.7)2(16.7)1(8.3)1.52±0.661.43±0.75对照组101(10.0)2(20.0)1(10.0)1(10.0)1(10.0)0.42±0.160.44±0.18P0.0000.0081.0001.0001.0000.0000.000

4 讨论

据流行病学调查结果显示[7-8],我国肺炎链球菌以19A、19F、3和14血清型多见,但不同地区、不同时期的流行菌株可能不同。不同血清型的致病毒力基因和敏感抗生素种类也不同[9-10]。

通过该研究得出,IPD和携带肺炎链球菌中血清基因型14、6A/6B和19F检出率比较差异无统计学意义,19A、6C和17F在IPD中检出率显著升高。提示19A、6C和17F基因型更具有侵袭性。检测IPD的6种致病毒力基因均明显高于对照组,对青霉素和红霉素不敏感率显著增加,对头孢吡肟、左氧氟沙星和美罗培南的敏感率比较差异无统计学意义。

高效疫苗对预防IPD的发生有重要临床价值[11]。肺炎链球菌疫苗有23 价多糖疫苗(PPV23)和荚膜多糖结合疫苗(PCV),PPV23 包含绝大多数的致病血清型,但无法诱导 T 细胞免疫反应,对2岁以下幼儿保护效果差[12]；PCV对婴幼儿有效,但仅包含7、10、11和 13价血清型[13]。13价对19A 血清型荚膜多糖抗原有较高的结合作用[14]。有研究提出[15-16],检测肺炎链球菌血清型的多位点序列(ST)对评估致病毒力基因的保守性,寻找更加有针对性的疫苗有重要应用价值。

综上所述,我院分离的IPD血清型主要有19A、6C和17F,共有6种致病毒力基因,对青霉素和红霉素耐药,针对不同血清型和致病毒力基因进行合理的疫苗和抗生素应用,对提高临床抗菌效果、减少耐药性产生有重要意义。

[1] WHO Publication.Pneumococcal vaccines WHO position paper-2012-recommendations[J].Vacine,2012,30 (32):4717-4718.

[2] 吕慧瑜,杨进.肺炎链球菌性疾病研究热点[J].应用预防医学,2016,22(4):376-378.

[3] 佘婷婷,徐元宏.肺炎链球菌耐药性及其耐药机制研究[J].国外医药:抗生素分册,2011,32(1):32-37,45.

[4] ACIP.Prevention of pneumococcal disease among infants and children-use of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine and 23-valent penumococcal polysaccharide vaccine.Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices(ACIP)[J].MMWR Recomn Rep,2010,59(11):1-18.

[5] 韩道宾,骆诗露,黄健,等.肺炎链球菌TCSs 中WalR 的克隆表达、保守性及抗原表位分析[J].生物技术通报,2016,32(7):194-199.

[6] O′Brien K L,Wolfson L J,Watt J P,et al.Burden of disease caused byStreptococcuspneumoniaein children younger than 5 years:global estimates[J].Lancet,2009,374(9693):893-902.

[7] 姚开虎,王立波,赵根明,等.北京上海广州深圳4家儿童医院肺炎住院患儿肺炎链球菌分离株的血清型分布[J].中国循证儿科杂志,2008,3(6):426-432.

[8] 余素飞,厉世笑,傅鹰,等.肺炎链球菌对大环内酯类的耐药机制研究[J].中华医院感染学杂志,2012,22(6):1118-1121.

[9] 钱婧,薛莲,谢贵林,等.171株儿童侵袭性肺炎链球菌血清分型和多位点序列分型研究[J].临床儿科杂志,2012,30(2):187-191.

[10]郭卫红,宋宏先,伍亚云.472株临床分离菌株的药敏试验结果分析[J].中华实验和临床感染病杂志：电子版,2015,9(1):46-48.

[11]杜国平,朱启镕.肺炎链球菌感染高危儿童的免疫预防[J].中国实用儿科杂志,2013,28(3):173-178.

[12]梁明斌,俞敏.肺炎链球菌多糖疫苗在高风险成人中的应用[J].浙江预防医学,2015,27(2):150-153.

[13]王颖童,王茜,张文超,等.肺炎链球菌疫苗在不同年龄组儿童中应用价值分析[J].实用预防医学,2016,23(5):545-547.

[14]张巧,林科雄,姚伟,等.肺炎链球菌表面蛋白A多价DNA疫苗交叉免疫保护作用评价[J].第三军医大学学报,2011,33(21):2230-2234.

[15]李娜,罗征秀,符州.肺炎链球菌疫苗免疫效应及研究进展[J].儿科药学杂志,2009,15(1):49-52.

[16]朱琳,刘国恩,李冬美,等.儿童七价肺炎球菌结合疫苗的成本效果分析[J].中国卫生经济,2013,32(4):74-75.