1.研究背景

研究表明，有五分之一以上的欧美人饱受慢性疼痛的困扰。临床数据表明睡眠和疼痛可以相互影响—疼痛会影响睡眠，同样睡眠不足可能会加剧疼痛。 如烧伤病人出院后是否出现失眠症状，是预测烧伤后慢性疼痛是否发生的一项指标；对于纤维肌痛的病人，不能恢复精神效果的睡眠往往与更多的疼痛相联系，反之恢复精神良好的睡眠可以缓解疼痛。 睡眠-觉醒模式和痛敏都受遗传、压力和环境的影响，而恰恰这些因素是在以人为研究目标的实验中不能控制的。为解决这个问题，我们使用杂交的C57BL/6J小鼠，在可控条件下使用多导睡眠监测记录系统 （脑电图EEG、肌电图EMG）来研究睡眠不足和痛敏之间的关系。

2.主要研究方法

过去在研究长期剥夺睡眠的啮齿类动物时，使用的标准实验流程往往涉及长时间强迫活动进而减少睡眠或剥夺选择性快速动眼睡眠 (REMS)，尽管以上实验流程改变了痛阈，但是到底是应激 (Stress)还是睡眠剥夺导致了痛敏是难以解释清楚的。

为了在不形成应激的情况下剥夺实验鼠的睡眠，本文的实验者采用持续不断地监测小鼠的脑电图和肌电图的方法。当非快动眼睡眠 (NREMS) 开始（一种睡眠尝试）时，在小鼠身边放置一个新物体（不触碰到小鼠）来唤醒小鼠。实验者发现小鼠的总NREMS时间平均减少了98±0.4%，而REMS在所有的实验鼠都消失了；伴随着睡眠剥夺持续时间延长 (12 h)，小鼠睡眠压力较高，尝试进入NREMS的次数更多，进入非干扰睡眠前的潜伏期变短。实验者通过常规的热痛和机械痛检测，对小鼠在睡眠剥夺了6、9或12 h后进行痛阈测定，进而对这种急性睡眠剥夺 (ASD) 进行了量效分析。

3.主要研究结果

对于睡眠剥夺了9或12 h的ASD雄鼠，与其基础痛阈以及对照组小鼠痛阈相比， ASD增加了小鼠对伤害性热刺激和机械刺激的反应，在恢复睡眠24 h后其痛阈恢复到基础痛阈水平；此外，睡眠剥夺9 h增加了在足底注射辣椒素 （一种TRPV1激动剂）ASD小鼠的伤害性反应（舔爪）；而雌鼠在ASD 9 h后的行为表型与雄鼠类似。无论是雄鼠还是雌鼠，ASD (9和12 h) 仅仅增加了对高机械力 (von Frey 0.4～2.0 g) 即伤害性刺激的反应，却不影响对低机械力 (0.07～0.16 g) 即非伤害性刺激的反应。即感受高机械刺激的痛觉感觉神经元受到了影响，而感受低机械阈值的神经纤维不受影响；温和的轻触刺激 (Brush) 以及丙酮诱发的冷痛却不受ASD的影响；在热梯度选择实验中，ASD 9 h的小鼠会选择避开热伤害刺激的温度（40～50 ℃）区域，这种选择行为在恢复睡眠一晚后回归正常。

为了研究由ASD产生的痛敏是否反应出一般性的高反应状态，实验者利用一系列不同强度的噪音刺激来检测小鼠的震惊反射。结果表明ASD 9 h后的实验鼠其震惊反射幅度降低（特别是对高强度脉冲的噪音），而不影响震惊反射的频率及反射潜伏期，睡眠恢复后可以使实验鼠已降低的震惊反射幅度恢复至实验前基础水平。

为了进一步验证以上发现是否适用于长期睡眠不足的情况，实验者又制作了一种温和的慢性睡眠剥夺(CSD) 实验模型。在前面的ASD模型中，每天造成小鼠6 h的睡眠剥夺不足以产生痛敏，但连续五天的6 h睡眠剥夺(在每天早上七点给光的时候开始)，这样的实验流程延长了刺激时间（睡眠剥夺时间），同时可以保证实验鼠血浆内的皮质酮保持在正常水平，这意味着可以使实验鼠处于非应激状态。在CSD过程中，由于实验鼠探索新物体的活动增加，而导致自发活动较实验前有所增加，但总的日常活动模式在睡眠剥夺期间与实验前基础值基本类似。

与基础值相比，CSD可显著降低实验鼠的NREMS时间（CSD 1 d减少98%，而持续5 d可以使减少95%），几乎没有REMS。被睡眠剥夺的五天里，实验鼠的睡眠压力在逐步增加，表现为在睡眠剥夺期间更多次地尝试进入NREMS和一旦有机会进入睡眠时的潜伏期缩短。

长时间清醒后则是反弹性睡眠，表现为NREMS和REMS时间均稳定地增加。尽管CSD导致实验鼠睡眠压力累计性增加，在实验的1、3和5 d时，一旦有机会进入睡眠时实验鼠表现出相似程度的反弹性的NREMS和REMS，导致实验鼠每天的睡眠时间不能完全恢复到实验前基础水平，这就意味着第5天后实验鼠的累计净睡眠缺乏达7.9±1.5 h。睡眠稳态的另一个指标是在NREMS期间增加了脑电图的慢波活动(SWA) (0.5～4.0 Hz)，也是睡眠缺乏和睡眠强度的一个指标。光谱分析表明，NREMS的SWA比实验前基础值增加约50%（14：00～19：00测量），并在CSD的1和5 d的NREMS过程中有着同等程度的累积和EEG分辨率，表明一旦有睡眠机会，睡眠剥夺鼠具有相似的向深度睡眠转换。

与基础阈值或者对照组小鼠相比，持续5 d的CSD会逐渐增强实验鼠的热痛敏，在第5 d时达到高峰。在CSD的第5 d，实验鼠对von Frey刺激诱发的机械痛敏也增强，然而对于非伤害性机械刺激（毛刷或者低强度的von Frey纤毛）的敏感性则没有变化。由于对照组小鼠在反复检测中的痛敏没有变化，同时CSD鼠在2 d的恢复性睡眠后，热痛敏和机械痛敏都恢复至基础阈值水平，所以实验者得出结论：对于CSD鼠，累积性睡眠不足导致了痛觉过敏。

小鼠睡眠期间被唤醒会导致睡眠质量降低。为了证实慢性（超过5 d）片段性睡眠是否改变了小鼠的痛敏阈值，实验者又设计了一种实验，每分钟将鼠笼向上进行一次快速但温和的运动，使实验鼠在有限的压力下和没有强制性自主活动的条件下醒来。这种干预将NREMS平均持续时间减少了约60%，总REMS时间减少了约65%，但却不影响实验鼠对伤害性热刺激和机械刺激的敏感性。

为进一步研究睡眠缺失导致痛敏的机制，实验者首先检测了环氧合酶(COX)是否在其中有着重要作用。炎症时花生四烯酸在COX作用下可以生成前列腺素，而前列腺素是伤害性感受器的增敏剂，并与睡眠受限后的自发性疼痛相关。研究发现，在9 h的ASD结束前30 min给予非选择性COX抑制剂布洛芬 (30 mg/kg)皮下注射，对睡眠剥夺诱发实验鼠的热痛敏和机械痛敏没有影响；而在睡眠剥夺9 h后，给予实验鼠皮下注射5 mg/kg的吗啡，该剂量能抑制正常鼠的热痛而不影响其机械痛阈，结果发现由睡眠不足引起的热痛敏略有缓解，而对机械痛敏则没有影响。总之，对于睡眠剥夺鼠，吗啡的镇痛作用有很大程度地减弱了。

为了研究睡眠不足所产生的痛敏是否与警觉性降低有关，实验者又使用了两种觉醒促进剂：A1和A2A腺苷受体拮抗剂Caffeine和促进多巴胺能神经递质传递的Moda fi nil。在9 h的ASD结束前2 h，用以上药物促进觉醒约3 h（20 mg/kg的Caffeine,45 mg/kg的Moda fi nil腹腔注射），可以减少实验鼠的睡眠尝试和延长NREMS的入睡潜伏期，表明提高了实验鼠的警觉性。在警觉提高期间，Caffeine和Moda fi nil均可阻断睡眠剥夺诱发的机械痛敏，并部分降低热痛敏。在热梯度选择实验中，Caffeine还能增加实验鼠在伤害性热区域的时间。但Caffeine并没有使睡眠剥夺鼠已经降低的听觉惊恐反射恢复到正常水平，而是预防了睡眠剥夺后通常发生的前脉冲抑制性惊厥缺陷，表明在一定程度上是通过调控感觉运动门控发挥作用的。在对照组中，Caffeine和Moda fi nil均不影响伤害性热痛敏、机械痛敏以及在足底注射完全弗氏佐剂后诱发的炎性痛敏，这表明Caffeine和Moda fi nil不是通过它们的镇痛效应进而抑制睡眠不足所诱发的痛敏的。

为了检测瞬时提高警觉性是否可以缓解CSD(5 d) 引起的痛敏，实验者在CSD最后一天的11：00时一次性给予Caffeine (20 mg/kg，腹腔注射)，发现可以阻断实验鼠的睡眠和痛敏，但不能改善睡眠不足，即在一旦有机会进入睡眠期间维持强劲的NREMS反弹。因此，瞬时恢复警觉性是可以改善CSD导致的痛敏。

4.讨论

无论是雄鼠还是雌鼠，无应激的CSD都可以诱发热痛敏、机械痛敏和增强炎性痛敏，这与人在睡眠剥夺一晚或两晚后观察到的症状是类似的。Caffeine和Moda fi nil对睡眠剥夺鼠具有镇痛作用表明，睡眠剥夺导致的警觉性降低是诱发痛敏的主要因素。尽管Caffeine和Moda fi nil通过不同的分子靶点发挥觉醒作用，但促进多巴胺能神经递质的释放是它们的共同点。睡眠剥夺可下调多巴胺的D2和D3受体，Caffeine恰恰可以上调D2和D3受体的表达，进而增加多巴胺与D2受体的结合，而Moda fi nil是通过抑制多巴胺转运蛋白进而促进了多巴胺能神经递质的功能。中脑边缘系统中的多巴胺在疼痛过程中发挥重要的调节作用，减少多巴胺能神经递质的释放可以增加健康受试者的疼痛和纤维肌痛病人的痛敏。 因此，睡眠剥夺引起多巴胺信号传递的减少可能是睡眠剥夺诱发痛敏的一个重要因素。

睡眠剥夺导致疼痛信号被放大，提高警觉性得以翻转，预示了可以研发一类新型镇痛药—“状态依赖性镇痛药”，此类药物不直接作用于疼痛的产生和发展过程，而是通过改善能促进疼痛恶化的生理病理环境进而缓解疼痛的。Caffeine是许多镇痛药的一种添加剂，但迄今为止还没有任何理论依据。所以，研究者推断咖啡因将对睡眠剥夺者有镇痛作用。虽然觉醒促进剂对睡眠不足引起的痛敏有效，但并不能消除随着时间推移而累积起来的实际性睡眠缺乏。个体在任何时候的疼痛程度都能够部分反映出他近期的睡眠状况和接触咖啡因的情况，这些因素都可能对临床镇痛实验产生复杂的影响，导致实验结果具有高度差异。例如，睡眠剥夺降低了吗啡的镇痛效果，引起人们担心睡眠不足会刺激病人提高吗啡的用量。因为睡眠本身可以缓解睡眠剥夺导致的痛敏，同时增加睡眠不足者（志愿者）的睡眠同样可以减轻痛敏症状，所以改善睡眠不足病人的睡眠状况，可能是缓解睡眠剥夺导致的疼痛和疼痛症状又影响睡眠的恶性循环，以及维持镇痛药最大疗效的一种有效的治疗策略。

(Alexandre C, Latremoliere A, Ferreira A,et al.Decreased alertness due to sleep loss increases pain sensitivity in mice. Nat Med, 2017, 23(6):768 ～ 774.徐州医科大学，张奉明 王 兵 译 刘兴君 校 )