马 良，范显峰，栗晓燕，薛红杰，贾泽玮，贾天军

(河北北方学院医学检验学院，河北 张家口 075000)

微小脲原体核糖体蛋白L23基因原核表达载体的构建及表达

马 良，范显峰，栗晓燕，薛红杰，贾泽玮，贾天军

(河北北方学院医学检验学院，河北 张家口 075000)

目的构建微小脲原体核糖体蛋白L23基因原核表达载体并表达蛋白，为研究微小脲原体的生物学特性提供依据。方法根据NCBI上的微小脲原体核糖体蛋白L23基因序列设计引物，以微小脲原体基因组DNA为模板，通过PCR扩增目的基因后进行纯化，利用限制性内切酶BamH I和NotI对原核表达载体pGEX-6P-2和目的基因进行双酶切，并通过T4连接酶连接，连接产物转化XL1-Blue感受态细菌后接种至含氨苄青霉素的LB固体培养基培养，对形成的菌落进行PCR筛选和质粒测序验证，利用IPTG诱导表达GST融合蛋白，表达产物超声裂解后经GST Sepharose 4B纯化，SDS-PAGE电泳鉴定。结果经PCR成功克隆出目的基因，全长345 bp，使用pGEX-6P-2质粒通用引物对转化有连接产物的大肠杆菌菌落进行PCR筛选鉴定，阳性菌落的PCR条带大小为468 bp，与预期相符，对筛选出的菌落扩大培养并提取质粒进行基因测序，测序结果与NCBI中的基因序列完全一致，对诱导表达的重组蛋白进行SDS-PAGE鉴定，融合蛋白分子量质约为36.6 kD，与预期一致。结论成功构建了微小脲原体核糖体蛋白L23原核表达载体，并在大肠杆菌中实现融合蛋白的表达，为微小脲原体核糖体蛋白L23基因以及解脲脲原体的后续研究奠定了基础。

微小脲原体；原核表达；核糖体蛋白；解脲脲原体

解脲脲原体(Ureaplasmaurealyticum)属于柔膜体纲支原体科脲原体属，是人类泌尿生殖道一种常见的条件致病微生物。根据几个高度保守基因的核苷酸序列、基因组大小等多个方面的差异，解脲脲原体可分为解脲脲原体(U.urealyticum)和微小脲原体(U.parvum)两个物种[1]。微小脲原体可引起如非淋菌性尿道炎、前列腺炎、子宫颈炎和盆腔炎等疾病[2-3]，并可通过母婴垂直传播导致新生儿肺病、脑膜炎等多种疾病[4-5]。微小脲原体是除生殖支原体外最小的可独立生存的微生物，且具有较独特的能量代谢方式，95%的ATP均由尿素水解产生[6]。核糖体蛋白L23是50S核糖体亚基的重要组成部分，后者对微生物蛋白质的合成具有重要意义[7-8]。微小脲原体核糖体蛋白L23的核苷酸与蛋白序列具有种属特异性，我们拟克隆出此基因，并进行其编码蛋白的表达，为了解其生物学功能以及微小脲原体的预防与治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

Primer STAR HS高保真酶、BamH I和NotI限制性内切酶、T4连接酶、DL2000 DNA marker购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；Glutathione Sepharose TM 4B微珠购自GE Healthcare公司；标准蛋白marker购自NEB公司；微小脲原体菌株hebnu uu3、XL1-Blue感受态细菌均为实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 目的基因扩增

根据NCBI上hebnu uu3株的50S核糖体蛋白L23基因核苷酸序列，利用Primer 5进行引物设计。上游引物:5′-CGC-GGATCC-ATGGAATTAACAAGAGTTATTTT-3′;下游引物:5′-TTTTCCTTTT-GCGGCCGC-CTACTTTGCGTTTGCTGCTT-3′(下划线部分为酶切位点)。以微小脲原体基因组为模板，PCR反应体系为100 μL：5×Primer STAR Buffer 20 μL，dNTP(2.5 mmol) 8 μL，上下游引物各4 μL，模板4 μL，Primer STAR高保真聚合酶1 μL，三蒸水59 μL。反应条件：98 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共40个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，利用酚-氯仿法纯化，-20℃保存。

1.2.2 原核表达载体构建

对扩增的目的基因和pGEX-6P-2载体质粒分别进行BamH I和NotI双酶切，对酶切产物再次进行酚-氯仿法纯化，使用T4连接酶进行过夜连接。使用热休克法将连接产物转化至XL1-blue感受态细菌中，将菌液涂布于含有氨苄西林(Amp)的LB固体培养基上，37 ℃培养16 h。从培养基上挑取半个菌落作为模板，利用pGEX-6P-2质粒通用引物进行菌落PCR鉴定，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析并记录。将扩增出目的片段的剩余半个菌落接种于含Amp的液体培养基中扩大培养，取3 mL菌液提取质粒，提取步骤按试剂盒操作书，提取的质粒送华大基因进行测序。

1.2.3 原核载体蛋白的诱导表达

取扩大培养的菌液加入含有Amp的TB培养基中，37 ℃振荡培养约3 h至A值达0.8后加入IPTG 12 μL，30 ℃诱导通气培养3 h，离心收集菌体后加入裂解液进行超声裂解，将裂解后的菌体离心，取上清后加入300 μL经预处理的Glutathione Sepharose TM 4B beads，室温翻转吸附2 h，对吸附后的beads离心并弃去上清，PBS溶液清洗3次，加SDS上样缓冲液后95 ℃变性5 min，离心后取上清进行SDS-PAGE和考马斯亮兰染色。

2 结 果

2.1 目的基因的扩增

对PCR扩增得到的目的基因进行琼脂糖凝胶电泳，获得与预期大小相符的条带,分子量约为345 bp(图1)。

M.DNA标准分子质量 1.目的基因PCR扩增条带图1 PCR扩增基因产物琼脂糖凝胶电泳图

M.DNA标准分子质量 1.目的基因菌落PCR扩增条带图2 菌落PCR鉴定结果

2.2 原核表达载体的构建

利用pGEX-6P-2通用引物进行菌落PCR，扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分析，在约468 bp位置处观察到一条特异性条带，与预期结果相符合(图2)。

2.3 对重组质粒进行测序鉴定

将重组质粒测序结果与NCBI中微小脲原体hebnuuu3株的核糖体蛋白L23基因序列通过BLAST进行比对，二者的同源性为100%,表明重组质粒构建成功(图3)。

2.4 融合蛋白的表达与鉴定

表达的融合蛋白经纯化后进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色，显示其分子质量约为36.6 kD(部分降解的GST为29 kD)，与预期结果一致(图4)。

图3 重组质粒测序结果比对图

M.蛋白标志物 1.目的蛋白SDS-PAGE条带图4 诱导表达产物的SDS-PAGE分析

3 讨 论

作为一种条件致病菌，微小脲原体可导致泌尿生殖系统的多种疾病，并与干眼症、高氮血症等疾病关联[9-10]。微小脲原体没有细胞壁，对β内酰胺类药物天然耐药；因不存在叶酸代谢途径，对磺胺类药物也具有抵抗力[11]。目前针对微小脲原体的治疗主要采用四环素类，大环内酯类和喹诺酮类3种药物。但由于抗生素滥用等原因，中国的微小脲原体菌株对大环内酯类和喹诺酮类药物的耐药性日益严重[12-13]，需要引起重视。50S核糖体是多种抗生素如大环内酯类、氯霉素类等的药物作用靶点，对核糖体蛋白的研究可能有助于对微小脲原体耐药机制的理解。

原核细胞核糖体沉降系数为70S，由较小的30S和较大的50S亚基组成。30S亚基由一个16S rRNA和约21个蛋白组成，而50S亚基由两个rRNA(5S rRNA和23S rRNA)和31个蛋白组成[14]。50S亚基可催化肽酰转移反应，防止肽链水解，并通过折叠多肽链辅助蛋白质的形成[7-8]。核糖体L23蛋白是50S亚基的重要组成部分。在大肠杆菌中，L23蛋白是维持其生长的关键蛋白之一，信号识别颗粒在核糖体的肽出口处与L23蛋白结合[15]，进而介导触发因子(trigger factor,TF)和核糖体之间的交联，而TF则是新生肽链结合的第一个分子伴侣，对于新生肽链的折叠以及成为功能蛋白具有重要作用[16]。还有研究表明，耶尔森菌属的核糖体L23蛋白是引起反应性关节炎的重要免疫显性抗原[17]。目前对微小脲原体核糖体L23蛋白的研究较少，通过BLASTP和SmartBLAST可以发现微小脲原体和解脲脲原体的蛋白序列同源性较高(≥97%)，但与其他细菌同源性较低(≤62%)，这可能与其独特的物质能量代谢有关。

本实验成功构建了微小脲原体核糖体蛋白L23基因原核表达载体，并表达了GST融合蛋白，为微小脲原体的后续研究提供了依据。

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ConstructionandExpressionofProkaryoticExpressionVectorofRibosomalProteinL23GeneofUreaplasmaParvum

MALiang,FANXian-feng,LIXiao-yan,XUEHong-jie,JIAZe-wei,JIATian-jun

(College of Medical Laboratory,Hebei North University,Zhangjiakou,Hebei 075000,China)

ObjectiveTo construct expression vector of ribosomal protein L23 gene ofUreaplasmaparvumand express its fusion protein,which may lay foundation for further exploiting in its biological characteristics.MethodsThe primers were designed according to the published NCBI gene sequence.The gene was amplified with PCR and purified.The target gene and vector PGEX-6P-2 were digested byBamH I andNotI,and then recombined with T4 DNA ligase.The recombinant plasmid was transformed into XL1-Blue bacteria,and the bacteria were inoculated into agar plates with LB medium and ampicillin.The colonies were identified by colony PCR and plasmid sequencing.The expression of GST fusion protein was induced by IPTG.The bacterial supersonic lysates were purified by GST Sepharose 4B and analyzed by SDS-PAGE.ResultsThe PCR product of ribosomal protein L23 gene ofUreaplasmaparvumwas about 345 bp in length.The recombinant plasmid was identified by colony PCR and the fragment of the PCR was 468 bp.The homology between sequenced results and the published sequence was 100%.The relative molecular mass of the fusion protein was about 36.6 kD which was consistent with the presumed protein.ConclusionThe prokaryotic expression vector was successfully constructed and the fusion protein was expressed inE.coli,which may be helpful for further study ofUreaplasmaparvum.

Ureaplasmaparvum;prokaryotic expression;ribosomal protein;Ureaplasmaurealyticum

来稿日期：2017-09-13

马良(1987-)，男，河北廊坊人，河北北方学院硕士研究生，主要从事解脲脲原体相关研究。

贾天军(1968-)，男，河北张家口人，教授，硕士生导师，主要从事抗感染免疫相关研究。

Q 78

A

10.3969/j.issn.1673-1492.2017.12.001

李蓟龙英文编辑刘彦哲]