李 慧, 张雅文, 罗翔宇, 赖天斌, 李海航

(1. 华南师范大学生命科学学院，广东省植物发育生物工程重点实验室, 珍稀动物研究与开发中心, 广州 510631; 2. 广州汇川医药科技有限公司, 广州 510410)

人工养殖鳄鱼油的提取与精制工艺研究

李 慧1,2, 张雅文1,2, 罗翔宇1,2, 赖天斌2, 李海航1*

(1. 华南师范大学生命科学学院，广东省植物发育生物工程重点实验室, 珍稀动物研究与开发中心, 广州 510631; 2. 广州汇川医药科技有限公司, 广州 510410)

以人工养殖的鳄鱼脂肪为材料，根据传统淡碱水解工艺的提取原理，采用淡碱水解-乙醇萃取方法，对鳄鱼油的提取和精制工艺进行优化，并用气相色谱-质谱(GC-MS)分析检测精制鳄鱼油成分，结果显示：用优化后的工艺制备鳄鱼油，精制油得率达75%，色素和腥臭味得到有效脱除； 鳄鱼油中含 25 种脂肪酸，其中不饱和脂肪酸含量占油脂总量的65.4%，不含铅、汞、砷等重金属. 该方法简单、高效，制备成本低，适合大量提取制备.

鳄鱼油； 淡碱水解-乙醇萃取； 脂肪酸； 提取精制工艺

鳄鱼是2亿多年前与恐龙同时代的、最古老的肉食性卵生脊椎类两栖爬行动物，是迄今生存着的最原始的动物之一. 鳄鱼全身都是宝，鳄鱼皮可制作高级皮革，鳄鱼肉有很高的营养价值和保健功能. 我国从1993年开始引进外来鳄种进行大量养殖，国家林业局于2003年批准尼罗鳄(Crocodylusniloticus)、湾鳄(Crocodyluspotosus)和暹罗鳄(Crocodylussiamensis)列入首批54种可商业化经营利用的野生动物名录. 我国现有鳄类养殖单位约140家，外来鳄鱼养殖场57个. 但鳄鱼的规模化加工和资源综合开发利用还停留在初步研究阶段[1].

鳄鱼体内粗脂肪含量为3.5%～7.0%[2]，鳄鱼油含不饱和脂肪酸高达71.5%，其中主要为亚油酸和花生四烯酸. 鳄鱼油脂肪酸组成有深海鱼油的特点，二十碳五烯酸(Eicosopentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA，)含量较高. 本草纲目记载，鳄鱼油脂主治皮肤病和恶疮，是最好的防冻防寒油[3]，还具有抗菌、抗炎[4]、促进皮肤烧伤愈合[5]等作用，已广泛应用于化妆品、防冻伤和消炎等药品及保健产品.

鳄鱼油提取和精制的报道较少. FOLCH等[6]采用有机溶剂提取鳄鱼油，此法仅限于实验室的少量制备，不适用于批量生产. 林珈好等[7]对超临界流体萃取法和干法熬制提取鳄鱼油进行了比较，结果表明，超临界流体萃取法提取率低，为32.6%；干法熬制虽然提取率较高，但高温加热使油脂的结构遭到破坏. 关于鳄鱼油精制工艺，李华亮等[8]开发了一种去腥除臭工艺，包括磷酸脱胶、碱炼脱酸、真空加热脱臭以及吸附脱色等多个步骤；宇海银等[9]使用硅胶-中草药吸附法对鳄鱼油进行脱臭，将鳄鱼油用有机溶剂溶解后，进行柱层析分离. 2种工艺均操作复杂，且用中草药吸附臭味物质的同时，有可能向鳄鱼油中引入其他成分. 目前仍缺乏有效的大量提取和精制鳄鱼油的工艺方法.

动物油脂的提取方法主要有熬制法、蒸煮法[10]、溶剂法[11]、酶解法[12]、超临界流体萃取法[13]和淡碱水解法[14]等. 淡碱水解法是利用稀碱水溶液水解脂肪组织中的蛋白质，使与蛋白结合的油脂解离出来，是鱼油提取工业中常用的方法[15]，具有出油率高、产品色泽浅、游离脂肪酸含量少等特点[16]. 本实验改进了传统的淡碱水解法，采用淡碱-乙醇萃取法对鳄鱼油提取精制工艺进行优化，重点考察对难以除去的色素和腥臭味的脱除效果.

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

实验材料：暹罗鳄的腹部脂肪，由广州汇川医药科技有限公司的海南省万宁鳄鱼养殖场提供. 取鳄鱼新鲜或冷冻保存的腹部脂肪，用40～50 ℃温水洗去表面血迹，除去血管和粘膜等非脂肪组织、沥干，在组织捣碎机中捣碎成脂肪糜备用.

实验试剂：95%乙醇为食品级，其他试剂为分析纯，均购于本地试剂公司.

脂肪酸成分分析仪器：7890A-5975C型气相色谱-质谱联用仪(美国安捷伦公司).

1.2 鳄鱼油的粗提取

1.2.1 鳄鱼油提取工艺流程 鳄鱼脂肪8 g →料液比1∶1加入淡碱-乙醇溶液提取→NaCl盐析分离→鳄鱼粗油→乙醇萃取→60 ℃蒸馏水洗涤→离心→灌装.

1.2.2 pH对鳄鱼油提取效果的影响 用1 mol/L的氢氧化钠溶液分别配制pH为7.0、8.0、9.0、10.0的淡碱溶液作为提取溶剂，计算得油率，比较不同pH对鳄鱼油提取效果的影响，得到提取溶剂的最佳pH.

得油率(%)=油质量(g)/原料质量(g)×100%

1.2.3 乙醇体积分数对鳄鱼油提取效果的影响 配制乙醇体积分数分别为40%、50%、80%的淡碱-乙醇溶液作为提取溶剂，以无乙醇的淡碱-乙醇溶液为对照，比较不同体积分数乙醇对鳄鱼油提取效果的影响，得到最佳乙醇体积分数.

1.2.4 提取温度对鳄鱼油提取效果的影响 以得到的最佳pH和乙醇体积分数配制提取溶剂，比较提取温度分别为60、70、80、90℃时对得油率的影响.

1.2.5 不同提取时间对鳄鱼油提取效果影响 用得到最佳提取溶剂，90 ℃水浴加热提取10～90 min，5 000 g 离心10 min，分离油相，计算得油率，得到最佳提取时间.

1.2.6 不同质量分数氯化钠和盐析时间对鳄鱼油提取效果的影响 在鳄鱼油的淡碱水解法得到的提取液中，分别加入质量分数为1% 和4% 氯化钠，时间为5、10、15 min, 盐析后5 000 g离心10 min，分离油相，计算得油率. 确定最佳盐析条件.

1.3 鳄鱼油的精制

1.3.1 工艺流程 100 g粗油(预热至60 ℃)→100 mL乙醇萃取2次→60 ℃蒸馏水洗涤3次→离心→灌装(加抗氧化剂，充氮气)

1.3.2 不同体积分数乙醇和pH对鳄鱼油精制效果的影响 分别用体积分数40%、60%、80%、95%,pH 3.0、6.0、9.0的乙醇溶液对鳄鱼油粗提物进行萃取，根据脱色脱臭效果和得油率确定最佳精制工艺.

1.4 鳄鱼油主要指标测定

外观和气味：感官判断酸值测定：参照GB/T 5530-2005.

酸值：称取20 g油脂，用热乙醇溶解油脂，氢氧化钾标准溶液滴定，滴定过程中要充分摇动，至溶液颜色发生变化，并且保持15 s不褪色，即为滴定终点. 记录滴定终点时氢氧化钠标准溶液用量，计算酸值:

酸值=56.1Vc/m，

其中:V为所用氢氧化钾标准溶液的体积(mL)；c为所用氢氧化钾标准溶液的准确浓度(mol/L)；m为试样的质量(g)；56.1为氢氧化钾的摩尔质量 (g/mol).

过氧化值测定：参照GB/T 5538-2005. 称取4 g油脂，用50 mL乙酸-异辛烷溶液溶解. 加入0.5 mL饱和碘化钾溶液，反应1 min±1 s后，立即加入30 mL蒸馏水. 上述溶液用硫代硫酸钠溶液搅拌滴定. 滴定至溶液黄色接近消失，添加0.5 mL淀粉溶液继续滴定至蓝色消失，即为终点. 记录硫代硫酸钠溶液用量，计算过氧化值:

过氧化值(mmol/kg)=1000(V-V0)c/2m，

其中：V为测定的硫代硫酸钠溶液的体积(mL)；V0为空白的硫代硫酸钠溶液的体积(mL)；c为硫代硫酸钠溶液的浓度(mol/L)；m为试样的质量(g).

精制鳄鱼油成分分析：精制鳄鱼油的脂肪酸组成及重金属由广州分析测试中心测定.

2 结果与分析

2.1 鳄鱼油的粗提取

鳄鱼油得油率随pH的升高而提高(图1A)，当pH≥9.0时，鳄鱼油得率不再增加. 在pH 9.0和pH 10.0时，鳄鱼油的提取率均达到76%～77%. 为确保油脂的充分提取，后续实验淡碱提取液pH为10.0. 与对照组相比，含有乙醇的淡碱提取液有利于油脂的提取(图1B). 乙醇体积分数为40%和50%的溶液作为提取溶剂，油脂提取率达到83.7%，比对照高7%. 而体积分数为60%乙醇溶液较40%和50%，得油率有所下降. 因此，后续实验选用pH 10.0、体积分数50%乙醇淡碱溶剂做为水解法提取鳄鱼油的提取溶剂.

以pH 10.0、50%乙醇淡碱溶液溶液作为提取溶剂，分别测定在60、70、80、90 ℃下油脂的得油率，结果如图1C所示. 各温度下油脂的得油率均达80% 以上，但60～80 ℃下提取的油脂较混浊，90 ℃ 提取的油脂为澄清的黄色液体，易与提取液分离. 因此，确定鳄鱼油的提取温度为90 ℃.

图1D可知，90℃下提取10 min，提取率达80%以上. 延长提取时间对鳄鱼油的提取率无影响. 确定提取时间为10 min.

在得到的鳄鱼油淡碱水解液中，加入质量分数1%和4%氯化钠进行盐析(图1E)，实验组粗油得率均为83%～84%，与对照组相比无显著差异. 但对照组油水界面不清晰，给后面的萃取和分离带来的困难. 加入1%或4%氯化钠后，油水界面清晰. 因此，选择加入1%氯化钠进行盐析.

比较了盐析时间对油脂提取的影响(图1F),盐析时间为5、10、15 min，油脂提取率为80%～81%， 不同的盐析时间得油率无显著差异. 因此，选择盐析时间为5 min.

图1 提取溶剂pH(A)、乙醇体积分数(B)、提取温度(C)、提取时间(D)、氯化钠质量分数(E)、盐析时间(F)对鳄鱼油得油率的影响

Figure 1 Effects of pH (A), ethanol concentration (B) of the hydrolysis solution, extraction temperature (C), extraction time (D), NaCl amount (E), and time for salting out the oil (F) on the yield of crocodile oil

2.2 鳄鱼油的精制

分别用体积分数40%、60%、80%、95%的乙醇溶液萃取粗油脱色脱臭，在乙醇体积分数40%～80%内，乙醇体积分数越高，脱色脱臭效果越好. 体积分数80%的乙醇溶液萃取效果最好(表1). 当乙醇体积分数增加至95% 时，脱色脱臭效果与体积分数80%的乙醇无显著差异，得油率较其他实验组有所增加，但萃取后的油脂有明显的乙醇气味.

体积分数80%的乙醇溶液调pH至 3.0、6.0和9.0，对油脂进行萃取，结果表明，碱性乙醇的脱色脱臭效果最佳(表1). 考虑到油脂在碱性条件下可能发生水解，导致油脂的损失，选择pH 9.0、体积分数80% 的乙醇溶液对粗油进行脱色脱臭. 按料液比(m∶V)为1∶1,对粗油萃取1～3次，萃取1次后的鳄鱼油呈浅黄色，仍有淡鱼腥味；萃取2次即可得到微黄色、无鱼腥味的鳄鱼油. 因此，选择pH 9.0、体积分数80%乙醇溶液按V(乙醇)∶m(粗油)为1∶1的比例对粗油萃取2次，用等量蒸馏水洗涤3次，最后通过离心使油水完全分离，得到的鳄鱼油为微黄色，无腥臭味. 精制鳄鱼油加入0.2%的维生素E，灌装，充氮气，于4 ℃ 避光密封保存.

2.3 精制鳄鱼油感官评价和理化指标测定

对精制鳄鱼油的外观和气味进行评价，测定酸值和过氧化值，并与精制鱼油一级标准(SC/T 3502-2000)进行比较. 结果表明(表2),精制鳄鱼油为微黄色，无腥臭味、无酸败味，符合精制鱼油一级标准. 精制鳄鱼油的酸值为(0.08±0.01) mg/g，过氧化值为0 mmol/kg，远低于精制鱼油一级标准规定的限度值，表明精制鳄鱼油的品质超过了一级鱼油标准.

表1乙醇体积分数、pH和萃取次数对粗鳄鱼油脱色脱臭效果的影响

Table 1 Effects of ethanol concentration, pH and fractionation times on decoloration and deodorization of crude crocodile oil

处理工艺得油率/%色泽、气味乙醇体积分数/%4093．4±1．11深黄色，腥臭味较浓6093．2±0．93深黄色，腥臭味较浓8093．4±0．80黄色，淡腥臭味9594．6±0．40黄色，淡腥臭味pH393．5±0．27黄色，淡腥臭味693．9±1．47黄色，淡腥臭味992．9±1．09浅黄色，淡腥臭味萃取次数198．9±0．27浅黄色，淡腥臭味298．1±0．44微黄色，无腥臭味397．7±0．92微黄色，无腥臭味

表2 精制鳄鱼油与一级精制鱼油的比较Table 2 Comparison of refined crocodile oil with the standard of first-grade refined fish oil

在脂肪糜和精制鳄鱼油中分别中加入质量分数0.2%的维生素E，按优化工艺提取精制，测定所得油脂的酸价，脂肪糜、对照组(无维生素E添加)及实验组的油脂酸值分别为0.465、0.079、0.028 mg/g. 实验组的酸值较对照组明显降低，说明添加抗氧剂有助于鳄鱼油抗氧化，提高了油脂品质.

表3精制鳄鱼油的脂肪酸组成及重金属含量测定

Table 3 Fatty acid profile and heavy metal content of refined crocodile oil

名称相对含量/%名称相对含量/%十二酸0．41二十碳一烯酸2．00十三酸0．06二十碳二烯酸0．30十四酸2．16二十碳三烯酸0．63十五酸1．21二十碳四烯酸1．00十六酸24．48二十碳五烯酸0．24十六碳一烯酸7．03二十二碳三烯酸0．33十七酸0．44二十二碳四烯酸0．53十七碳一烯酸0．18二十二碳五烯酸0．58十八酸5．72二十二碳六烯酸1．25油酸36．30铅未检出亚油酸14．54汞未检出二十酸0．15砷未检出亚麻酸0．46

GC-MS对精制油的成分进行分析，结果见表3. 精制鳄鱼油含25种脂肪酸，不饱和脂肪酸含量为65.4%，其中单不饱和脂肪酸占45.5%，多不饱和脂肪酸占19.9%，精制油中未检出铅、汞、砷等重金属物质. 结果表明，该鳄鱼油提取与精制工艺可制备高品质鳄鱼油.

3 分析与讨论

本实验研究了淡碱水解法提取鳄鱼油的pH、乙醇体积分数、提取温度和提取时间等对提取效果的影响. pH是影响油脂提取的重要因素[17]，实验首先优化了淡碱溶液的pH. 实验证明，鳄鱼油提取率随pH的升高而提高. 进一步探究了提取溶剂对油脂提取的影响，结果表明，淡碱-乙醇溶液更有利于油脂的提取. 而且，提取溶剂中含有乙醇能同时萃取油脂中的游离脂肪酸等杂质，提高粗油的品质，有利于后续的除杂精制. 但乙醇体积分数太高会造成油脂的损失，80%乙醇溶液提取时，粗油得率有所下降. 90 ℃下提取10 min，鳄鱼油已被充分提取，提取率达80%以上. 延长提取时间对鳄鱼油的提取率无影响. 为避免油脂在长时间加热下发生水解，确定提取时间为10 min. 加入氯化钠对鳄鱼油的提取率无显著影响，但盐析后的油水界面清晰. 这与文献[18]报道的结果一致，氯化钠可破坏组织残渣和皂化物等杂质形成的乳胶体，使油澄清. 通过优化提取工艺 ，鳄鱼油得油率达到83.8%±0.9%，较文献报道[7]的提高了23.7%.

鳄鱼油的精制包括除去粗油中的游离脂肪酸、胶质、色素和腥臭味成分等杂质. 本实验证实高体积分数的乙醇有助于油脂脱色脱臭，但乙醇体积分数过高可能增加其与油脂的互溶，使油脂中残留的乙醇增加.

水产品的腥臭味限制了其在食品、化妆品等领域的应用. 文献[19]报道，不饱和脂肪酸的氧化是导致鳄鱼油腥味的重要因素. 阙婷婷等[20]分析暹罗鳄腥味成分，认为是脂肪分解后产生的小分子醛类物质共同作用构成了较浓的腥味. 因此，提取、精炼过程中油脂的抗氧化十分重要. 因此实验在提取精制过程中加入维生素E作为抗氧剂，有效地保护了油脂，提高了油脂品质.

4 结论

本实验建立了淡碱水解-乙醇萃取法从人工养殖的鳄鱼脂肪中提取和制备高品质鳄鱼油的最佳工艺： 新鲜或冷冻保存的暹罗鳄腹部脂肪，用温水清洗,打碎成脂肪糜，按料液比1∶1(m∶V)加入pH10.0、体积分数50%乙醇和质量分数0.2%的维生素E，90 ℃下搅拌提取10 min后，加入1%氯化钠盐析5 min，离心得粗鳄鱼油. 粗鳄鱼油按V(乙醇)∶m(粗油)为1∶1，用pH 9.0的80%乙醇萃取2次，除去有机杂质；再用蒸馏水洗3次，离心得鳄精制鱼油. 该工艺操作简单，适用于工业上大量制备油脂.

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Study on the Extraction and Refinement of the Oil from Cultured Crocodile

LI Hui1,2, ZHANG Yawen1,2, LUO Xiangyu1,2, LAI Tianbin2, LI Haihang1*

(1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development, College of Life Sciences and R & D Center for Rare Animals, South China Normal University, Guangzhou 510631; 2. Guangzhou Huichuan Medicinal Technology Ltd., Guangzhou 510410)

In this study, we established a mild alkali-ethanol extraction method for the extraction and refinement of crocodile oil from cultured crocodile fat. The refined oil was obtained at a yield of 75% of the fat materials, without unfavorable and fishy smell; GC-MS analysis indicated that the refined oil contains 25 kinds of fatty acid and the unsaturated fatty acids accounted for 65.4% of oil, and is free of lead, mercury and arsenic. This work provides a simple and efficient method for large-scale preparation of high quality crocodile oil.

crocodile oil; mild alkali-ethanol extraction; fatty acids; extraction and refinement method

2016-08-18 《华南师范大学学报(自然科学版)》网址：http://journal.scnu.edu.cn/n

2015年中央农业技术推广项目(粤农财2015, No. 60-43)；广东省科技计划项目(项目编号2014A010107026)

*通讯作者:李海航，教授，Email:li8341@163.com.

Q819

A

1000-5463(2017)06-0071-06

【中文责编：成文；助理编辑：冷佳奕 英文审校：李海航】

·简讯· 《华南师范大学学报(自然科学版)》被评为“广东省精品科技期刊”

2017年12月14—15日，广东省科学技术期刊编辑学会第六次会员代表大会暨学会成立20周年庆祝大会在广东省恩平市召开，会上举行了“第六届广东省精品、优秀、特色科技期刊”的评选及表彰活动. 在这次评选活动中，共评出精品期刊19种、优秀期刊31种、特色科技期刊32种. 《华南师范大学学报(自然科学版)》被评为“精品科技期刊”.

近年来，《华南师范大学学报(自然科学版)》通过刊发我校“高水平大学重点学科群”稿件，吸引校外优质稿源，使刊物的影响得到较大提高. 据《中国学术期刊影响因子年报(自然科学与工程技术)》统计，《华南师范大学学报(自然科学版)》的期刊影响力指数由2016年的114.837上升到2017年的246.206，复合影响因子由2016年的0.489上升到2017年的0.686，期刊综合类影响因子由2016年的0.344上升到2017年的0.450.