江涛，周兵，付丹，利园梦

(1.九江市第一人民医院 妇科，江西 九江 332000；2.九江市第一人民医院 病理科，江西 九江 332000；3.九江市第一人民医院胸心外科，江西 九江 332000)

·基础研究·

地锦草对Hela细胞增殖与凋亡的影响△

江涛1*，周兵2，付丹3，利园梦1

(1.九江市第一人民医院 妇科，江西 九江 332000；2.九江市第一人民医院 病理科，江西 九江 332000；3.九江市第一人民医院胸心外科，江西 九江 332000)

目的探讨中药地锦草对Hela细胞增殖和凋亡作用的影响。方法以人宫颈癌Hela细胞株为研究对象，采用MTT法检测地锦草对Hela细胞增殖抑制作用的影响，AO/EB染色法荧光倒置显微镜观察药物作用后凋亡小体的形成，Annexin V-FITC流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡变化情况。结果地锦草能够抑制Hela细胞的体外增殖，抑制程度随药物浓度50 μg·mL-1升高到200 μg·mL-1，抑制率也由30.4%增大到61.1%，显示了良好的浓度依存关系(P<0.05)；AO/EB染色法显示药物作用后凋亡小体形成，FCM法结果显示随着药物作用质量浓度由0增高到200 μg·mL-1，细胞凋亡率也由0.76%升高到57.17%(P<0.05)。结论地锦草能够抑制Hela细胞增殖。其作用可能是通过诱导Hela细胞凋亡和分化实现的。

地锦草；Hela细胞；增殖；凋亡

传统中医药认为地锦草具有清热止痢、凉血止血等功效，常用于治疗痢疾、肠炎及出血。随着科学技术的进步，对地锦草进行了成分提取，发现富含黄酮、甾醇、酚等多种化合物，分别具有免疫调节、抗炎抗菌等生物学活性，且疗效确切，副作用较小[1]。近年来，也有学者通过研究发现地锦草提取物可能在抗肿瘤、体外诱导肿瘤细胞凋亡方面有一定作用，但具体机制尚不清楚[2]。其中体外实验，特别是对抑制Hela细胞增殖与凋亡的机制性研究尚少。本实验为进一步开发和利用这一中药资源，观察地锦草对宫颈癌Hela细胞增殖和凋亡作用的影响，为地锦草可能成为一种新的抗肿瘤药物提供实验基础。

1 材料

地锦草(安徽毫州市永刚饮片厂有限公司)，经本院查红云主管药师鉴定为地锦Euphorbiahumifusawilld.或斑地锦EuphorbiamaculataL.的干燥全草，本院药剂科中药饮片室自行粉碎研磨地锦草，兑蒸馏水反复煮沸过滤4次后，调整药液终质量浓度为200 μg·mL-1。RPMI-1640培养基(Roswell Park Memorial Institute)购于GIBCO公司，胎牛血清(无支原体)为PAA公司产品，噻唑蓝(Multiply-table Tournament)试剂盒、AO/EB染液、Annexin V-PI、Annexin V-FITC试剂盒为美国sigma公司产品。宫颈癌Hela细胞株购于上海肿瘤研究所。

2 方法

2.1 细胞系及培养

宫颈癌Hela细胞接种于10%的胎牛血清、1%双抗的RPMI-1640培养液中，置于恒温37 ℃、CO2体积分数为5%的细胞培养箱中常规培养，常规换液。

2.2 细胞形态观察

取对数生长期的Hela细胞，调整终浓度为4×104·mL-1，细胞爬片到载玻片上，接种到6孔板中，培养12 h，实验组按照终质量浓度为200 μg·mL-1加药，0.9%氯化钠溶液为对照组，继续培养48 h，取玻片在倒置显微镜下镜检。

2.3 细胞凋亡形态学观察

取对数生长期的Hela细胞，调整为2×104个·mL-1，接种到六孔板，每孔1.5 mL，按照200 μg·mL-1浓度加药，对照组加等量0.9%氯化钠溶液，在细胞培养箱内继续孵育48 h。取上述处理细胞悬液100 μL，加入5 μL AO/EB染液混均，滴于玻片，荧光显微镜下观察。

2.4 细胞毒性检测

取对数生长期的Hela细胞，调整细胞终浓度为4×104mL-1，种植于96孔板，CO2培养箱培养12 h。实验组每孔加入10 mL药物至终质量浓度为50、100、200 μg·mL-1，对照组加10 mL 1640培养液，继续培养24 h。每组设6个复孔，每孔加入10 μL MTT溶液后继续孵育4 h，继续加入10 μL甲臜溶解液，继续培养 6 h，震荡5 min，570 nm处测定吸光度A值。抑制率=(1-A实验/A对照)×100%。

2.5 细胞凋亡检测

取对数生长期细胞，按4×104mL-1接种于24孔板孵育6 h，按终浓度分别为0.0、50、100、200 μg·mL-1加药，每组设3个复孔，继续作用48 h，收集处理后的细胞，磷酸盐缓冲液冲洗，去上清液，加入200 μL Annexin V-FITC结合液，室温放置10 min。离心去除上清液，加入150 μL Annexin V-FITC结合液吹打重悬细胞，混匀冰浴避光放置。加入10 μL碘化丙啶染色液，上流式细胞仪检测细胞凋亡。

2.6 统计学处理

3 结果

3.1 药物作用前后形态学变化

对照组Hela细胞生长旺盛呈多角形、密集贴壁簇状生长。而终质量浓度为200 μg·mL-1的药物作用组可见细胞不再贴壁生长，细胞皱缩、聚集、悬浮，生长停滞、死亡(见图1)。

注：A.对照组；B.200 μg·mL-1组。图1 药物作用细胞48 h后形态变化

3.2 细胞凋亡形态学观察

处理后细胞AO/EB荧光染色5 min后，显微镜下观察，对照组细胞薄膜完整，呈现绿色均匀荧光。药物组作用48 h后，出现胞膜突触，胞核固缩断裂，呈现桔黄色不均匀荧光，见图2。

注：A：对照组；B：200 μg·mL-1组。图2 AO/EB免疫荧光双染色

3.3 地锦草对Hela细胞生长的抑制作用

当地锦草的作用浓度由50 μg·mL-1增高到200 μg·mL-1时，对宫颈癌Hela细胞的抑制率由30.4%增大到61.1%，呈现浓度依赖性(见表1)。

表1 不同质量浓度的地锦草对Hela细胞增殖的影响

注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。

3.4 地锦草作用Hela细胞48 h后细胞凋亡变化

地锦草作用Hela细胞48 h后，Annexin-V/PI双染结果显示，左上、左下、右上和右下象限分别表示为坏死、存活、早期凋亡和晚期凋亡细胞。实验组Hela细胞经50.0、100.0和200.0 μg·mL-1的地锦草处理48 h后，其凋亡率分别为(17.47±0.28)%、(19.73±0.29)%、(57.17±0.29)%，对照组为(0.76±0.15)%，与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见图3。

注：A.0 μg·mL-1；B.50 μg·mL-1；C.100 μg·mL-1；D.200 μg·mL-1。图3 流式细胞仪检测Hela细胞的凋亡情况

4 讨论

宫颈癌是仅次于乳腺癌的全球女性中第二常见恶性肿瘤，每年全球约有52万例新发病例，引起近27万人死亡，其中80%发生在发展中国家，并逐渐年轻化，其中大约10%患者在30岁以下。对宫颈癌的治疗早期以手术为主，晚期多选择放疗或同步放化疗。放疗会导致各种近期的副反应及晚期并发症，特别是放疗导致患者卵巢及阴道等损伤，年轻患者往往难以接受。对于早期宫颈癌术后有高危因素的患者， 特别是不愿意接受盆腔放疗的年轻宫颈癌患者，采用术后化疗可有效保留阴道功能，但化疗对卵巢功能会造成不可逆损伤，对VI期及复发宫颈癌放化疗效果均差[3]。因此，开发高效低毒的抗癌新药，会产生良好的社会效益及经济效益。而我国传统的中医药为此提供了一个良好的方向，研究证明，部分中药都能有效地在体外对恶性肿瘤细胞存在着杀灭的作用[4]。因此从天然中草药中筛选具有抗癌及缓解放化疗副反应的活性成分已成为当前肿瘤治疗的热点之一。

恶性肿瘤的产生被认为是细胞增殖与凋亡失衡的共同结果[5]，而肿瘤细胞的促凋亡蛋白和基因的高表达又是目前抗肿瘤研究的热点，其基因与蛋白的靶向治疗被认为是今后临床抗肿瘤的方向[6]。研究发现体内过氧化物含量升高会导致细胞内DNA损伤，如果修复不及时，引起细胞染色体复制紊乱，正常的细胞周期失控甚至癌变。而多项研究表明地锦草中的黄酮成分具有多种生物活性。黄酮类化合物中的酚羟基能与铁离子络合阻止羟自由基的生成，保护机体减少过氧化物的侵害，从而减少了癌变的几率。体外研究发现黄酮类化合物对人胃癌MKN-45细胞株、人宫颈癌Hela细胞株、人肝癌SMMC-77221细胞株增殖具有明显的抑制作用，并呈剂量和时间依赖性。玮罕等研究发现，用地锦草水提取物灌胃宫颈癌模型小鼠两周后，能明显抑制肿瘤的生长，抑瘤率达47.7%[7]。Vidya等[8]研究表明黄酮类化合物槲皮素能显著抑制Hela细胞的增殖，并呈剂量依赖性。认为槲皮素对Hela细胞作用是通过阻滞细胞周期G2/M并诱导了线粒体途径的细胞凋亡。有报道提示地锦草黄酮通过诱导肿瘤细胞的凋亡启动了线粒体依赖途径[9-11]。线粒体凋亡途径主要由Bcl-2家族蛋白介导，临床资料显示，在发现癌变的肿瘤组织细胞中，如宫颈癌、胃癌、直肠癌及乳腺癌等，Bcl-2家族中的致癌基因均过表达。Bcl-2能够在线粒体膜上阻断细胞色素C的释放，具有凋亡抑制因子的作用，而Bax具有促凋亡因子的作用。它们的功能效应通常依赖在Bcl-2和Bax表达之间的平衡。以往的研究显示，黄酮类化合物作用肿瘤细胞后可通过影响Bcl-2和表达Bax蛋白来改变线粒体膜的通透性，进而影响caspas-9和-3的活性诱导凋亡。

本实验通过选取传统抗炎药物地锦草，通过现代工艺萃取不同浓度提取液梯度作用于Hela细胞，其增殖抑制作用显示良好的药物浓度依赖关系。在诱导细胞凋亡方面，地锦草提取物作用48 h后显微镜下可见细胞凋亡小体的形成，而FCM法显示了细胞的凋亡率伴随着药物浓度的增高而增大。证实了地锦草提取物能通过诱导Hela细胞的凋亡来达到抑制其增殖的目的。由于目前本工作尚在初级阶段，且均为体外研究为主，并且地锦草的提取物中含有多种抗肿瘤成分，包括黄酮、多糖及皂苷等多种活性物质，药物毒性和副反应尚不确切，余下的机理尚待我们接下来进一步做更加深入的研究，以便为将来地锦草抗肿瘤的临床应用提供理论及实验依据。

[1] 杜海红，丁红，刘永红.地锦草有效成分总黄酮测定方法的建立及提取工艺[J].山西医科大学学报，2012，43(12)：932-935.

[2] 邹志坚，刘海云，王晓敏.地锦草水提液对移植性肝癌的抑制作用研究及对凋亡蛋白表达的影响[J].中国实验方剂学杂志，2013，19(21)：241-245.

[3] 华克勤，丰有吉.实用妇产科学[M].北京：人民卫生出版社，2013：542-543.

[4] 周香，郑继行，盛维为，等.青蒿琥酯诱导胃癌细胞发生胀亡及其机制研究[J].中华普通外科杂志，2012，27(5)：524-526.

[5] Na D，Liu F N，Miao Z F，et al.Astragalus extract inhibits destruc-Tion of gastric cancer cells to mesothelial cells by anti-apoptosis[J].World J Gastroenterol，2009，15(5)：570-577.

[6] 罗湘玉，郑雪松，罗卫民.非小细胞肺癌中RECK的表达及临床意义[J].中国医药导报，2012，9(12)：46-48.

[7] 玮罕，耿果霞，李青旺，等.地锦草抗宫颈癌活性研究[J].中国畜牧兽医，2010，37(3)：192-193.

[8] Vidya P R，Senthil M R，Maitreyi S，et al.The flavonoid quercetin induces cell cycle arrest and mitochondri-mediated apoptosis in human cervical cancer(Hela)cells through P53 induction and NF-κB inhibition[J].Eur J Pharmacol，2010，649(1/3)：84-91.

[9] Westphal D，Dewson G，Czabota P E，et al.Molecular biology of Bax and Bak activation and action[J].Biochim Biophys Acta，2011，1813(4)：521-531.

[10] Tait S W，Green D R.Mitochondria and cell death：Outer membrane permeabilization and beyond[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2010，11(9)：621-632.

[11] Lindsay J，Esposti M D，Gilmore A P.Bcl-2 proteins and mitochondria-specificity in membran targeting for death[J].Biochim Biophys Acta，2011，1813(4)：532-539.

EffectsofEuphorbiahumifusaonProliferation，ApoptosisofHelaCervicalCancerCells

JIANGTao1*，ZHOUBing2，FUDan3，LIYuanmeng1

(1.Departmentofgynaecology,JiujiangFristHospital,Jiujiang332000,China；2.DepartmentofPathology,JiujiangFristHospital,Jiujiang332000,China；3.Departmentofthoracicsurgery,JiujiangFristHospital,Jiujiang332000,China)

Objective：To investigate the effects ofEuphorbiahumifusaon proliferation，apoptosis of Hela cervical cancer cells.MethodsThe Hela cell line was used for the study.The inhibition ofE.humifusaon the proliferation of Hela cells was assayed by MTT.Apoptotic cells was determined using the AO/EB staining，and cell apoptosis was detected by flow cytometry (FCM).ResultsE.humifusacould inhibit the growth of Hela cell，the inhibitory rate increased with the drug concentration by the 50 μg·mL-1to 200 μg·mL-1，inhibition rate also increased from 30.4% to 61.1% in concentration dependent manners(P<0.05).FCM revealed that the percentage of cells that underwent apoptosis mounts from 0.76% to 57.17% as the treated concentration was elevated from 0 to 200 μg·mL-1.ConclusionE.humifusacan efficiently inhibit the proliferation of Hela cells，maybe by the way of leading to its apoptosis.

Euphorbiahumifusa；Hela cell；proliferation；apoptosis

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.12.011

江西省卫计委科技计划(2015A079)

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江涛，副主任医师，研究方向：妇科肿瘤基础与临床；Tel：(0792)8571342，E-mail：jt7519@126.com

2017-04-25)