李嘉欣，王鹏思，王玉洁，石上梅，薛健*

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；2.国家药典委员会，北京 100061)

·基础研究·

中药材地龙中七种指示性多氯联苯残留量测定研究△

李嘉欣1，王鹏思1，王玉洁1，石上梅2*，薛健1*

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；2.国家药典委员会，北京 100061)

目的建立动物源性中药材地龙中持久性有机污染物多氯联苯残留量的测定方法。方法对样品提取方法中的提取溶剂、溶剂用量、提取时间进行正交试验，对两种净化方法(磺化-碱性氧化铝柱净化、GPC-碱性氧化铝柱净化)的净化效果进行比较，最终确定样品用正己烷-丙酮(1∶1)超声提取，提取液经磺化-碱性氧化铝柱净化，正己烷洗脱，氮吹浓缩后经气相色谱法测定，外标法定量。结果7种指示性多氯联苯在0.002～7.0 mg·L-1范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999 0，检出下限在0.006～0.025 mg·kg-1，定量下限在0.020～0.084 mg·kg-1，回收率在83.8%～105.3%，RSD在3.2%～7.5%。结论本方法简便、快捷、灵敏度高、准确性好，适用于动物源性中药材中指示性多氯联苯残留量的测定。

地龙；多氯联苯；气相色谱法；残留测定

多氯联苯(polychlorobiphenyls，PCBs)又称氯化联苯，是一类人工合成有机物，是联苯苯环上的氢原子为氯所取代而形成的一类氯化物，共有209个同系物异构体[1]。多氯联苯是典型的环境持久性有机污染物，被《斯德哥尔摩公约》规定为优先控制的12种持久性有机污染物之一[2]。据估计，全世界多氯联苯(PCBs)的总产量约120万吨，其中约30%已释放到环境中，60%仍存在于旧电器设备或垃圾填埋场中，并将继续向环境中释放[3]。PCBs的理化性质十分稳定，不易分解或降解，可通过一系列的挥发、扩散、对流等过程在空气、水、土壤等介质中迁移或转化[4]。PCBs具有低水溶性、高脂溶性的特点，因此易在脂肪组织中溶解，通过不断的生物富集和食物链传递进而对人体健康产生威胁，不仅在环境中造成广泛污染，也对动物和人类的神经、免疫、生殖、内分泌等系统造成较大伤害[5]。尽管20世纪70年代后期各国陆续停止生产和停止使用多氯联苯PCBs，但其对环境和人体健康的影响依然普遍存在。全球环境监测系统/食品规划部分(GEMS/FOOD)中规定了7 种“指示性PCB”单体(PCB28、PCB52、PCB101、PCB118、PCB153、PCB138、PCB180)作为监测多氯联苯(PCBs)污染情况的指标[6]。我国颁布的GB2762-2012《食品安全国家标准食品中污染物限量》也是以这7种指示性PCBs单体的总和作为指标，并规定水产动物及其制品中PCBs的限量为0.5 mg·kg-1[7]。

地龙(Pheretima)作为我国传统的动物源性中药材，其用药历史悠久，具有清热定惊、通络、平喘、利尿的功能[8]。现阶段，国内外学者对于地龙的研究主要集中在其活性成分及药理作用的开发，随着降压、抗血栓、抗心律失常、抗肿瘤、免疫调节、镇痛消炎等新功效的不断发现，其药用价值越来越受到重视，临床应用也越发广泛[9]。然而，对地龙中富含的有害物质的检测却鲜有报道。由于地龙喜在富含腐殖质的土壤中生活，导致环境中的一些污染物易在地龙体内蓄积，并以此为源头在食物链中进行转移，最终影响人类健康，因此有必要对地龙中的环境污染物残留量进行检测。目前国内外鲜有报道适用于中药材中PCBs残留量的分析方法，已有的该类污染物的残留检测方法如GC-ECD、GC-MS、生物分析法和免疫分析法等均是针对于环境、食品类样品[5，10-13]。因此，本研究以我国传统中药材地龙为研究对象，通过对样品前处理过程中提取方法的正交试验及净化方法的比较研究，建立了高效、简便、高灵敏度的中药材中PCBs残留检测方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

6890N气相色谱仪(美国Agilent公司)，配电子捕获检测器(ECD检测器)；高纯氮气(纯度≥99.999 2%，北京氦普北分气体工业有限公司)；JSP-750A高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；PL203/01电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；TP-150超声波清洗机(北京天鹏电子新技术有限公司)；80-2离心沉淀器(江苏省金坛市医疗仪器厂)；Preplinc GPC凝胶渗透色谱仪(美国J2 Scientific公司)；HGC-12A氮吹仪(天津市恒奥科技发展有限公司)。

1.2 材料

正己烷(色谱纯，美国Fisher公司)；丙酮、正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、环己烷、无水硫酸钠、硫酸(分析纯，北京化工厂)；碱性氧化铝(100～200目，国药集团化学试剂有限公司)；多氯联苯混合标准品(14 mg·L-1，上海安谱科学仪器有限公司)。

随机从北京市10个药店收集地龙样品，样品分别产自广西、广东、上海、河北、山东、北京地区，经中国医学科学院药用植物研究所张本刚研究员鉴定为正品。

2 方法

2.1 气相色谱条件

进样口温度：290 ℃，不分流进样，进样量：1 μL；检测器温度：300 ℃，尾吹气(氮气)：60 mL·min-1；DB-5石英毛细管色谱柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)，恒流模式，柱流量：1.0 mL·min-1；程序升温(90 ℃保持1 min，20 ℃·min-1速度升至180 ℃，保持1 min，以3 ℃·min-1速度升至300 ℃，保持2 min)，外标法定量。

2.2 标准品溶液的制备

精密量取多氯联苯混合标准品5 mL于10 mL茶色容量瓶中，用色谱级正己烷稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为7 μg·mL-1的7种多氯联苯混合标准品储备溶液，置于-20 ℃冰箱保存，备用。

2.3 样品提取方法

地龙样品粉碎后过60目筛，精密称取粉碎后样品2.00 g，转移至100 mL具塞三角瓶中，加入1 mL质量浓度为2 mg·mL-1多氯联苯混合标准品溶液，混匀过夜。加入无水硫酸钠1 g，按照表1、2的正交试验设计超声提取后，将滤液过滤至梨形瓶中。将收集到的滤液于40 ℃水浴中减压浓缩至近干。将浓缩液用正己烷定量转移至10 mL具塞刻度试管中，定容至5 mL，净化后测定其平均回收率，每个处理3个重复。

表1 多氯联苯残留量测定提取方法的正交试验因素水平表

表2 多氯联苯残留量测定提取方法的正交试验表

2.4 样品净化方法

2.4.1 磺化-碱性氧化铝柱净化 取地龙空白样品，按上述提取方法制得5 mL提取液后，小心加入含10%水的浓硫酸1 mL，振摇1 min，于3000 r·min-1条件下离心10 min，取上清液。取1根洁净的玻璃色谱柱(12 mm×250 mm)，关闭活塞，玻璃柱底端填入少量玻璃棉后，从下向上依次装入2.5 g活化碱性氧化铝(660 ℃中活化6 h)、2 g无水硫酸钠。用30 mL正己烷预淋洗，待液面到达柱面顶部后，将1 mL上清液转移至色谱柱上，用10 mL正己烷溶液洗脱，收集洗脱液于10 mL刻度试管中，氮吹至1 mL，待GC分析测定。

2.4.2 GPC-碱性氧化铝柱净化 取地龙空白样品，按上述提取方法制得5 mL提取液后，经凝胶渗透色谱仪进样，洗脱液为乙酸乙酯-环己烷(1∶1)，流速为5 mL·min-1，收集11～16 min的洗脱液。将1 mL GPC洗脱液加入预先用30 mL正己烷淋洗过的上述碱性氧化铝柱上，用10 mL正己烷溶液洗脱，收集洗脱液于10 mL刻度试管中，氮吹至1 mL，待GC分析测定。

3 结果

3.1 色谱行为

取7种多氯联苯混合标准品溶液2 mg·L-1，按2.1仪器工作条件进行测定，7种多氯联苯混合标准品的出峰情况见图1。实验从被测物质的性质考虑，选用弱极性的DB-5毛细管色谱柱。由图1可知，在该实验条件下，各化合物的色谱峰峰形良好，均能达到基线分离，满足外标法定量要求。

注：1.PCB28；2.PCB52；3.PCB101；4.PCB118；5.PCB153；6.PCB138；7.PCB180。图1 7种多氯联苯混合标准品溶液气相色谱图

3.2 提取方法的选择

本研究采用简单、经典的超声波提取方法。由于多氯联苯的极性随其所含氯原子数的增多而减弱，因此，低氯多氯联苯则更易被极性溶剂萃取，而高氯多氯联苯则更易被非极性溶剂萃取。根据待测物的性质，选择正己烷、正己烷-丙酮(1∶1)、正己烷-二氯甲烷(1∶1)3种溶剂进行对比。考虑到提取时间及提取溶剂用量对提取结果的影响，对提取溶剂、提取时间、提取溶剂体积3个因素进行了正交试验，结果见表3。

表3 多氯联苯残留量测定提取方法的正交试验回收率(n=3)

由表3可以看出，在试验1的条件下，7种多氯联苯的回收率在82.5%～106.0%，较其他条件回收率好。因此，实验的提取方式确定为以50 mL正己烷-丙酮(1∶1)作为提取溶剂分两次进行提取，每次超声提取30 min。

3.3 净化方法的选择

动物性中药材作为一类生物源性样品，其所含基质成分较为复杂，对目标分析物的痕量测定有较大干扰，因此需要通过一定的方法对提取液进行处理，去除干扰以保证测定方法的准确性。地龙体内富含蛋白质、脂肪、核苷酸、酶等生物活性成分，因此在进行基质净化时，主要对这些有机大分子物质进行去除并分离。去除的方法大致可分为两类：一类是破坏性去除，如浓硫酸磺化法、强碱皂化法等；另一类是非破坏性去除，如凝胶渗透色谱法(GPC)、吸附柱法、透析法、低温沉降法等。分离常采用色谱柱色谱法，如氧化铝柱(酸性、中性、碱性)、弗罗里硅土柱、硅胶柱、活性炭柱[14-16]。由于多氯联苯为对酸稳定的有机卤素污染物，因此本研究比较了常用的破坏性磺化法与非破坏性凝胶渗透色谱法，并结合碱性氧化铝柱进一步净化，将基质的去除与分离相结合，确定了适用于地龙基质的净化方法。

碱性氧化铝柱一般使用正己烷作为洗脱剂，通过测定多氯联苯混合标准品溶液的流出曲线，考察其在碱性氧化铝柱上的洗脱行为。结果表明在0～5 mL和5～10 mL均有标准品溶液流出，10 mL后不再流出，故洗脱剂正己烷的体积为10 mL。同样对GPC的洗脱行为进行考察，结果表明前11 min内无标准品溶液流出，11～16 min有标准品溶液流出，16 min后不再流出，故洗脱剂收集时间为11～16 min。空白样品通过两种不同净化方法的净化效果如图2所示。

注：A.磺化-碱性氧化铝柱净化法；B.GPC-碱性氧化铝柱净化法。图2 不同净化方法下空白样品溶液净化后的色谱图

从图2中可以看出，在多氯联苯混合标准溶液流出的10～30 min内，磺化-碱性氧化铝柱比GPC-碱性氧化铝柱的净化效果好，净化后的空白样品基质干扰峰较少。由此可见，GPC对于地龙基质而言并不适用。因此，实验的净化方法确定为磺化-碱性氧化铝柱净化法。

3.4 方法学考察

3.4.1 线性关系及检出下限 将多氯联苯混合标准溶液分别配制成质量浓度为0.002、0.02、0.2、1、2、3.5、7 mg·L-1的系列标准工作溶液，进样量1 μL，在确定的色谱条件下进行测定。以试样浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行回归计算，各PCB的线性方程和相关系数结果见表4。结果显示，各PCB在质量浓度0.002～7.0 mg·L-1的范围内，r均大于0.999 0，线性关系良好。根据标准品溶液在仪器中的检出浓度，对加标空白样品经处理后测定信噪比，以信噪比(S/N)为3测得方法的检出下限(LOD)；以信噪比(S/N)为10测得方法的定量下限(LOQ)。结果显示，PCBs的检出限在0.006～0.025 mg·kg-1，定量下限在0.020～0.084 mg·kg-1。

表4 各PCB线性方程和相关系数

3.4.2 准确度和精密度 准确称取地龙样品2.00 g，分别精密添加多氯联苯混合标准品溶液，得到0.2、2.0、3.5 mg·kg-1多氯联苯添加样品，按照实验确定的操作进行提取、净化，重复3次，7种PCB在不同添加浓度下的回收率和精密度结果见表5。测定结果显示7种PCB在3个添加浓度下的回收率在83.8%～105.3%，相对标准偏差在3.2%～7.5%，PCB混合标准品溶液与添加样品溶液色谱图见图3。

表5 地龙中PCBs的回收率及精密度(n=3)

注：A.2 mg·L-1多氯联苯混合标准品溶液；B.2 mg·kg-1空白地龙添加样品溶液。图3 多氯联苯混合标准品与空白地龙添加样品溶液色谱图

3.5 样品测定

经过以上实验，本研究最终确定的分析方法为：地龙样品粉碎后过60目筛，精密称取粉碎后样品2.00 g，转移至100 mL具塞三角瓶中。加入无水硫酸钠1 g，再加入正己烷-丙酮(1∶1)30 mL 超声提取30 min，静置，过滤。样品残渣再用正己烷-丙酮(1∶1)20 mL重复提取1次，静置，过滤，合并所有滤液于梨形瓶中。将收集到的滤液于40 ℃水浴减压浓缩至近干。将浓缩液用正己烷定量转移至10 mL具塞刻度试管中，定容至5 mL。小心加入含10%水的浓硫酸1 mL，振摇1 min，于3000 r·min-1条件下离心10 min。取上清液1 mL，加入预先用30 mL正己烷淋洗过的碱性氧化铝柱上。用10 mL正己烷溶液洗脱，收集洗脱液于10 mL刻度试管中，氮吹至1 mL，即得。

按照本实验确定的方法对收集样品进行测定，结果显示各样品中均未检出PCBs残留。

4 结论

本研究建立的中药材地龙中7种指示性PCBs残留量的气相色谱测定方法，在选定的色谱条件下，各PCBs的分离效果较好。样品前处理方法简便快捷、成本较低，既能使目标分析物提取完全，又不受干扰物质的影响。本方法的检出下限远远低于食品安全国家标准对PCBs的限量标准，灵敏度较高，准确度和精密度均能达到分析要求，可适用于中药材中污染物的监督检测。

此外，由于本研究检测的样品量较少、样品采集地域较为局限，还需进行更大范围的普查与检测，从而全面准确的对其质量进行评价。

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StudyonDeterminationofResiduesof7IndicativePolychlorobiphenylsinTraditionalChineseMedicinePheretima

LIJiaxin1，WANGPengsi1，WANGYujie1，SHIShangmei2*，XUEJian1*

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalScience&PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China；2.ChinesePharmacopoeiaCommission，Beijing100061，China)

Objective：To develop a method for the determination of residues of persistent organic pollutants polychlorobiphenyls (PCBs) in Pheretima derived from traditional Chinese medicine of animal origin.MethodsOrthogonal experimental design was carried out on the extraction solvent，dosage of solvent and extraction time in the sample extraction method.The purification effect of two kinds of purification methods：sulfonation-basic alumina column purification and GPC-basic alumina column purification were compared.The method was determined as follows: sample was extracted ultrasonically with n-hexane and acetone (1∶1), the extract obtained was purified by sulfonation-basic alumina column and eluted by n-hexane, the eluant was concentrated by nitrogen blowing instrument, and finally the concentrate was determined by gas chromatography and quantified by external standard method.ResultsGood linearity was obtained when the concentration of 7 indicative polychlorobiphenyls were within 0.002-7.0 mg·L-1，the correlation coefficients (r) were all greater than 0.999 0.The limit of detection and the limit of qualification were among 0.006-0.025 mg·kg-1and 0.020-0.084 mg·kg-1，respectively.The recoveries were in the range of 83.8%-105.3%，with the relative standard deviation (RSD) among 3.2%-7.5%.ConclusionThis method is simple，rapid，sensitive and accurate，which is suitable for the determination of residues of indicative polychlorobiphenyls in traditional Chinese medicine of animal origin.

Pheretima；polychlorobiphenyls (PCBs)；gas chromatography；residue determination

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.12.010

国家重大新药创制专项(2009ZX09502-027)

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石上梅，主任药师，研究方向：中药质量标准研究，E-mail：ssm@chp.org.cn；薛健，研究员，研究方向：中药有效成分分析及质量控制、中药有害物质研究，E-mail：jxue@implad.ac.cn

2017-06-15)