刘皓，曲一丹，刘兴基，李卫红，桑慧，司艳红，商战平

(泰山医学院，山东泰安271000)

·基础研究·

白藜芦醇后处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的影响及机制

刘皓，曲一丹，刘兴基，李卫红，桑慧，司艳红，商战平

(泰山医学院，山东泰安271000)

目的探讨白藜芦醇后处理对肾脏缺血再灌注(I/R)损伤的影响及其机制。方法将60只大鼠随机分为假手术组、模型对照组、白藜芦醇低剂量组及白藜芦醇高剂量组，每组各15只。模型对照组、白藜芦醇低剂量组及白藜芦醇高剂量组制备急性肾脏I/R模型，假手术组仅行假手术，对双侧肾脏不进行处理。白藜芦醇低剂量组及白藜芦醇高剂量组造模成功后，待肾脏血流恢复后用16号灌胃针进行灌胃给药。假手术组及模型对照组术后立即灌胃0.9%NaCl溶液2 mL。给药处理24 h后，经腹主动脉取血，检测血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)水平。取左侧肾脏，配成肾组织匀浆，检测丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性。采用HE染色法观察病理学变化，Paller法进行肾小管坏死程度评分。结果白藜芦醇低、高剂量组血清BUN、Cr水平均低于模型对照组(P均<0.05)，白藜芦醇高剂量组血清BUN、Cr水平均低于白藜芦醇低剂量组(P均<0.05)。白藜芦醇低、高剂量组肾组织MDA含量低于模型对照组，SOD活性高于模型对照组(P均<0.05)；白藜芦醇高剂量组肾组织MDA含量低于白藜芦醇低剂量组，SOD活性高于白藜芦醇低剂量组(P均<0.05)。白藜芦醇低、高剂量组肾脏组织病理学改变较模型对照组明显缓解，白藜芦醇高剂量组缓解更明显。白藜芦醇低、高剂量组肾小管坏死程度评分低于模型对照组，白藜芦醇高剂量组低于白藜芦醇低剂量组(P均<0.05)。结论白藜芦醇后处理可明显改善肾脏I/R损伤大鼠的肾功能指标、减轻肾脏组织损伤，其机制可能与抑制肾脏组织氧化应激反应有关。

白藜芦醇；肾脏；缺血再灌注损伤；药物后处理；氧化应激

肾脏缺血再灌注(I/R)损伤在临床中多见，其大多发生于休克、血管手术或肾脏移植术过程中[1]。肾脏I/R损伤是导致急性肾衰竭(ARF)的常见原因，是导致患者死亡的重要原因[2]。近些年，用药物后处理的方法来改善肾脏I/R损伤的方式引起了更多的关注。白藜芦醇是一种天然多酚类化学物质，具有抑制炎症反应、抗肿瘤作用和抗氧化作用等多种功能，并可显著减轻多种器官的I/R损伤[3]。但既往大多采用白藜芦醇预处理的方式研究其对肾脏I/R的保护作用，对其在肾脏I/R损伤后处理中的作用尚不明确。2016年5～12月，我们观察了白藜芦醇后处理对肾脏I/R模型大鼠的影响，探讨白藜芦醇后处理对肾脏I/R损伤的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 健康雄性Wistar大鼠60只，CL级，8周龄，体质量200～250 g，由山东大学实验动物中心提供。白藜芦醇购自美国Sigma公司；考马斯亮蓝、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、血尿素氮(BUN)及血肌酐(Cr)含量测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；戊巴比妥钠购自南京都莱生物有限公司。

1.2 动物分组与模型制备 采用简单随机化法将60只大鼠按照1∶1∶1∶1分配到假手术组、模型对照组、白藜芦醇低剂量组及白藜芦醇高剂量组，每组各15只。模型对照组、白藜芦醇低剂量组及白藜芦醇高剂量组制备急性肾脏I/R模型，腹腔注射2%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉，腹正中线行小切口，将两侧肾蒂游离并剥离周围组织，结扎右肾肾蒂，使用动脉夹将左肾肾蒂夹闭48 min后松开移去，恢复血流再灌注，然后逐层缝合。移除动脉夹后，当观察到肾表面颜色从暗紫色变化为血色时，表明血流恢复，急性肾脏I/R模型制备成功。假手术组只进行腹部小切口操作后，用0.9%NaCl溶液湿润的消毒纱布进行覆盖，对双侧肾脏不进行任何处理。

1.3 干预方法 白藜芦醇低剂量组及白藜芦醇高剂量组造模后立即进行后处理，进行灌胃给药，待肾脏血流恢复后用16号灌胃针进行灌胃给药。假手术组及模型对照组术后立即灌胃0.9%NaCl溶液2 mL。

1.4 血清BUN、Cr水平测定 给药后处理24 h后，麻醉大鼠，开腹经腹主动脉取血，离心留取血清，依照试剂盒的操作说明，检测血清BUN、Cr水平。

1.5 肾组织MDA含量及SOD活性测定 取血后处死各组大鼠，取左侧肾脏，取部分肾皮质，配成10%的肾脏组织匀浆，依照试剂盒标准操作方式检测MDA含量及SOD活性。

1.6 肾组织病理组织观察及肾小管坏死程度评分取肾脏组织，制备石蜡切片，采用HE染色法观察组织学形态与病理学变化。按Paller法[4]进行肾小管坏死程度评分，评分标准：肾小管扩张、细胞扁平为1分；肾小管腔内有脱落、 坏死的细胞，无管型或细胞碎片为2分；上皮细胞颗粒变性为1分；空泡变性为1分；细胞核固缩为1分。

2 结果

2.1 各组血清BUN、Cr水平比较 模型对照组血清 BUN、Cr水平均高于假手术组(P均<0.05)。白藜芦醇低、高剂量组血清BUN、Cr水平均低于模型对照组(P均<0.05)。白藜芦醇高剂量组血清BUN、Cr水平均低于白藜芦醇低剂量组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组血清BUN、Cr水平比较

注：与模型对照组比较，*P<0.05； 与白藜芦醇低剂量组比较，#P<0.05。

2.2 各组肾组织MDA含量及SOD活性比较 模型对照组肾组织MDA含量高于假手术组，SOD活性低于假手术组(P均<0.05)。白藜芦醇低、高剂量组肾组织MDA含量低于模型对照组，SOD活性高于模型对照组(P均<0.05)。白藜芦醇高剂量组肾组织MDA含量低于白藜芦醇低剂量组，SOD活性高于白藜芦醇低剂量组(P均<0.05)。见表2。

2.3 各组肾脏组织病理学表现及肾小管坏死程度评分比较 假手术组肾脏组织形态结构正常，小管管腔完好，未见间质水肿与组织炎细胞浸润现象，上皮细胞无水肿、坏死。模型对照组肾脏组织形态结构明显异常，小管管腔显著扩张，上皮细胞出现明显的肿胀、坏死，并且出现管型、炎细胞浸润、间质水肿现象。白藜芦醇低、高剂量组肾脏组织形态结构均有轻微变化，小管上皮细胞以肿胀为主，坏死罕见，炎细胞浸润、间质水肿的现象与模型组相比显著缓解，管腔中见到脱落细胞以及管型的现象明显少于模型对照组，病理学改变较模型对照组明显缓解。白藜芦醇高剂量组病理改变较白藜芦醇低剂量组明显改善。假手术组、模型对照组、白藜芦醇低剂量组、白藜芦醇高剂量组肾小管坏死程度评分分别为(1.15±0.32)、(35.87±1.50)、(4.50±1.41)、(8.76±1.60)分，模型对照组高于假手术组，白藜芦醇低、高剂量组均低于模型对照组，白藜芦醇高剂量组低于白藜芦醇低剂量组(P均<0.05)。

表2 各组肾组织MDA含量及SOD活性比较

注：与模型对照组比较，*P<0.05； 与白藜芦醇低剂量组比较，#P<0.05。

3 讨论

目前，对肾脏I/R损伤进行药物预处理的预防与治疗的研究已取得较好的进展[5]，显示出明显的治疗效果。但在实际的临床诊疗中，更多见的是由于肾脏发生缺血后造成损伤来就医的，目前并无法在缺血发生之前预知其发生，进而采用药物预处理进行干预，这一局限性限制了药物预处理方法在临床I/R损伤治疗中的应用。药物后处理指的是在组织器官缺少血液灌流较长时间的情况下，在血流恢复之前或者开始恢复数分钟以内用药[6]。对I/R损伤进行药物后处理的方式具有事后性的特点，是近年来提出的新的器官保护策略，并且具有广阔的研究前景。因此，探讨对肾脏I/R损伤进行药物后处理治疗更加重要。

白藜芦醇是一种存在于浆果、花生皮、葡萄等中的天然多酚类化学物质，具有许多有益的健康效应，如抗炎、抗衰老、抗肿瘤等。近年研究发现，白藜芦醇具有较强的抵抗氧化损伤的功能，可作为一种活性氧(ROS)清除剂[6]。白藜芦醇还能够通过转录调节来调节抗氧化酶活性，增加抗氧化作用，是一种有效的抗氧化剂[16]。研究发现，白藜芦醇可显著减轻多种器官及组织如骨骼肌、神经、心脏、肝脏、胃、肠道及肾脏的I/R损伤[7～13]。白藜芦醇拥有对脏器I/R损伤较好的保护作用与良好的应用价值，是近年来的研究热点。本研究发现，模型对照组血清 BUN、Cr水平高于假手术组，提示肾脏I/R损伤导致了大鼠肾功能损害,血清BUN、Cr水平显著增加，并出现肾脏的病理性损害；白藜芦醇低、高剂量组血清BUN、Cr水平均低于模型对照组，白藜芦醇高剂量组血清BUN、Cr水平均低于白藜芦醇低剂量组，提示使用白藜芦醇后处理给药后减轻了上述改变，能够明显减轻肾脏I/R损伤，起到保护肾功能与降低肾脏病理性损害的作用，并且高剂量应用时的保护作用更明显。

研究显示，肾脏I/R损伤出现时高度破坏肾组织，并启动了一系列促使细胞凋亡和坏死的程序。这些有害的效应被证实是由于肾再灌注时由ROS产生的[14]。特别是在再灌注期间，I/R后发生的组织损伤与部分组织中增加的氧化应激反应密切相关[15]。在肾脏I/R损伤的进程发生时，ROS在机体内开始形成并积聚，从而使得氧自由基持续产生。同时，肾脏细胞线粒体缺氧使抗氧化物酶的活性减弱，清除氧自由基的作用降低，机体自由基防御系统受到了破坏，导致了氧化应激损伤细胞，进而促进细胞死亡。SOD是人体中主要存在的自由基清除剂，对保护肾脏组织抵抗自由基所造成的损害有重要意义，其活性水平可以用于评价机体自由基的清除作用。多不饱和脂肪酸存在于生物膜当中，体内ROS能够与它产生化学变化，导致脂质过氧化(LPO)现象出现，以致于生成能够对组织细胞产生损伤的毒害性产物，如MDA。MDA能够有效衡量体内自由基对细胞损伤程度，有助于判断LPO的发生对组织细胞所造成的损伤水平。本研究发现，模型对照组肾组织MDA含量高于假手术组，SOD活性低于假手术组，提示大鼠急性肾脏I/R的发生导致了机体氧化应激的损伤；白藜芦醇低、高剂量组肾组织MDA含量低于模型对照组，SOD活性高于模型对照组，提示白藜芦醇后处理能够显著减少肾脏I/R损伤中肾组织MDA含量、提升SOD活力，表明应用白藜芦醇对急性肾脏I/R损伤进行后处理能够有效降低体内氧自由基含量，并加强肾组织对自由基清理的功能，以此来抵抗LPO损伤，能够使机体抵御氧化毒性产物对组织细胞的破坏，减少组织细胞的损伤与坏死，从而进一步减轻I/R损伤；白藜芦醇高剂量组肾组织MDA含量低于白藜芦醇低剂量组，SOD活性高于白藜芦醇低剂量组，提示高剂量应用时的保护作用更明显。

临床上肾脏I/R损伤是出现急性肾功能衰竭的主要原因，可导致肾血管阻力增加、肾小球滤过率下降、肾小管坏死等。本研究发现，模型对照组肾脏组织形态结构明显异常，小管管腔显著扩张，上皮细胞出现明显的肿胀、坏死，并且出现管型、炎细胞浸润、间质水肿现象，提示肾脏I/R损伤造成了肾组织的严重损伤；白藜芦醇高剂量组、低剂量组肾脏组织病理形态结构与模型组相比显著缓解，提示该药物可减弱肾脏I/R损伤，减轻肾组织受损的程度；白藜芦醇高剂量组病理改变较白藜芦醇低剂量组明显改善，提示高剂量应用时可更好地减轻肾组织病理改变。本研究发现，模型对照组肾小管坏死程度评分高于假手术组，提示肾脏I/R损伤造成了肾组织中大量肾小管损伤，肾小管受到严重破坏；白藜芦醇低、高剂量组低于模型对照组，白藜芦醇高剂量组低于白藜芦醇低剂量组，提示白藜芦醇可减轻肾组织肾小管的损伤程度，对肾脏起到一定的保护作用，并且高剂量应用时可更好地减轻肾组织肾小管的损伤程度。

综上所述，白藜芦醇后处理可减轻肾脏I/R损伤，改善肾脏功能、减轻肾组织肾小管的损伤程度，其作用可能与抑制氧化应激反应有关，从而减少了氧化应激所造成组织损伤，表明白藜芦醇后处理对肾脏I/R模型大鼠的肾脏具有保护作用。然而，由于肾脏I/R损伤发生机制、该药物的作用机理以及药物后处理机制的复杂性，白藜芦醇后处理对抗肾脏I/R损伤的机制有待更进一步研究。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.46.008

R692

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国家级大学生创新创业计划项目(201610439014)。

商战平(E-mail: zhpshang@tsmc.edu.cn)

2017-04-16)