王亚南，陈昭华，陈卫昌

[1.苏州大学附属第一医院，江苏 苏州 215006；2.苏州市立医院(南京医科大学附属苏州医院)，江苏 苏州 215002]

临床研究·论著

结肠癌血清microRNA表达谱的检测及临床应用价值*

王亚南1，陈昭华2，陈卫昌1

[1.苏州大学附属第一医院，江苏 苏州 215006；2.苏州市立医院(南京医科大学附属苏州医院)，江苏 苏州 215002]

目的找寻潜在的新型的结肠癌血清microRNA（miRNA）表达谱，探讨其临床应用价值。方法miRNA微阵列芯片技术检测结肠癌患者和正常人血清中miRNA表达的差异，并对有差异表达的miRNA在60例结肠癌患者血清和60例正常对照组血清中的表达进行实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）验证。结果①芯片杂交结果中共有87种miRNAs在结肠癌患者血清和正常人血清标本中有差异表达，其中上调表达有39个，下调表达有48个。②qRT-PCR对miRNAs进行验证，其中miR-31、miR-141、miR-224-3p、miR-576-5p和miR-4669这5个miR分子在结肠癌症患者中的表达相对于正常对照组差异具有统计学意义（P＜0.05）。③miR-31、miR-141、miR-224-3p、miR-576-5p和miR-4669这5个miR分子组成的miR-表达谱诊断结肠癌的效率较高（ROC曲线下面积为0.992）。结论临床检测结肠癌患者miR-31、miR-141、miR-224-3p、miR-576-5p和miR-4669循环分子标志物表达谱有助于诊断结肠癌，有望成为结肠癌患者临床诊疗评估的重要指标。

结肠癌；血清microRNA；miRNA

结肠癌（colon cancer）的发生发展受多种因素的影响，是个多基因相关、多步骤的复杂过程。microRNA（miRNA）是一种长度为19～24个核苷酸，进化上高度保守的内源性非编码单链小RNA，广泛存在于动植物中。自1993年LEE等[1]在秀丽隐杆线虫研究中发现了第一个miRNA-let4以来，截至2011年miRbase已收录140个物种的15 000条miRNAs基因位点和17 000条不同的miRNAs序列[2]。目前有关研究[3-6]表明，miRNA的异常表达与结肠癌的发生发展有着密切联系。本技术利用miRNA微阵列芯片技术检测结肠癌患者血清和正常人血清中miRNA表达的差异，并对有差异表达的miRNA进行实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）验证，以找寻潜在的新型的结肠癌血清miRNA表达谱。

1 资料与方法

1.1 研究对象

芯片筛选miRANs标本来源，收集苏州市立医院住院的结肠癌患者血清样本3例，其中，男性1例，女性2例，且其均未接受任何手术治疗、放疗或者化疗，但均经病理学检查确诊。组织病理类型的判断参照WHO病理分期。3例健康对照血清来自医院体检者。收集苏州市立医院住院的结肠癌患者血清样本60例，其中，男性30例，女性30例，且其均未接受任何手术治疗、放疗或者化疗，但均经病理学检查确诊。组织病理类型的判断参照WHO病理分期。60例健康对照血清来自医院体检者。具体资料见表1。

1.2 实验方法

1.2.1 血清标本处理 在结直肠癌患者术前、结肠息肉患者术前和正常人体检时用一次性真空采血管采集空腹静脉血5 ml，3 000 r/min，离心5 min，分离血清，取1 ml血清离心后于-80℃保存。

1.2.2 miRNA芯片检测 3例结肠癌患者血清和3例正常人血清标本送至中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所进行miRNA UniTag™微阵列芯片（无标记miRNA芯片分析方法）检测[7]。结果经过数据分析，根据改变倍数≥1.5且P＜0.05筛选与正常人血清相比在结肠癌患者中有差异表达的miRNA。

表1 结肠癌患者临床资料

1.2.3qRT-PCR检测miRNA的表达 血清RNA抽提，吸取血清250μl与Trizol 750μl于2 ml离心管中，充分震荡混匀。按说明书操作进行RNA提取。紫外分光光度仪测定总RNA的吸光度（A260/280 nm）比值，取比值在1.8～2.2的标本用于后续试验。miRNA3'末端加Poly（A）处理及逆转录反应按照miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒说明书（天根公司）操作进行。qRT-PCR按照miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒说明书（天根公司）操作。总反应体系为20μl，包括2×miRcute miRNA Premix（含SYBR、ROX）10μl，10μmol/L正向、反向引物各0.4μl，miRNA 第一链 cDNA 2μl，50×ROX 参比染料1.6μl，ddH2O 5.6μl。循环参数 ：94℃预变性 2 min，94℃ 20 s，60℃ 34 s，共43个循环。以miR-16作为内参照[8]，对目标基因进行归一化处理，确保以相等数量的样品比较目标基因的量。实验设3个复孔。结果用2－△△Ct法[9]计算。取10μl qRT-PCR扩增产物，用30 g/L琼脂糖凝胶电泳，结果用百瑞凝胶成像仪观察并拍照。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。采用单样本Kolmogorov-Smirnov检验法对数据进行正态分布检验，因数据不符合正态分布，计量资料以中位数和四分位数间距，组间数据比较采用Wilcoxon检验，P＜0.05为差异有统计学意义。以手术切除的结肠癌组织病理报告为金标准，绘制血清miRNAs诊断结肠癌的ROC曲线，计算ROC曲线下面积及渐进95%可信区间。

2 结果

2.1 结肠癌患者血清中miRNA的芯片表达谱

芯片杂交结果经过数据分析，根据改变倍数≥1.5且P＜0.05筛选与正常人血清相比在结肠癌患者中有差异表达的miRNA。共有87种miRNA在结肠癌患者血清和正常人血清标本中差异有统计学意义，其中上调表达有39个，下调表达有48个。差异表达的87种miRNA的热图结果见图1、表2。

2.2 qRT-PCR对miRNAs进行验证

通过查阅文献，在芯片筛选出的87种差异表达的miRNA中有12种与结肠癌的细胞分化、转移等相关[10]。用qRT-PCR对这12种miRNA进行验证。其中 miR-31、miR-141、miR-224-3p、miR-576-5p和miR-4669这5个miR分子在结肠癌症患者中的表达相对于正常对照组差异有统计学意义。结果见图2、表3。

2.3 ROC曲线分析

以手术切除结肠癌组织的病理报告为金标准，绘制 miR-31、miR-141、miR-224-3p、miR-576-5p和miR-4669及由这5个miR分子组成的miR-表达谱在诊断结肠癌中的ROC曲线。见图3、表4。

图1 结肠癌患者和正常人血清标本miRNA芯片结果热图

表2 结肠癌患者血清中差异表达的miRNAs

图2 miRNAs在结肠癌组和正常对照组血清中的表达

表3 miRNAs在结肠癌组和正常对照组血清中的表达

图3 miRNAs诊断结肠癌ROC曲线

表4 miRNAs诊断结肠癌ROC曲线下面积及渐进95%可信区间

3 讨论

结肠癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一。结肠癌发展过程主要涉及增生、腺瘤和癌变各阶段，是一种多步骤、多阶段、多基因参与的疾病。近年来，miRNA在结肠癌发生发展中的作用成为人们研究的热点。目前研究表明，miRNA具有癌基因和抑癌基因的作用。miRNA微陈列芯片凭借其高通量，快速检测miRNA表达水平的优点，成为了研究肿瘤发病机制，早期诊断，预后判断的新方法。

本技术采用的UniTag™微陈列芯片是中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所开发的非标记miRNA芯片检测平台（涵盖2 154个全谱miRNA，version 19.0），该平台“基于堆积杂交的通用标签检测方法”可以区分只有1个碱基差异的miRNA家族成员，尤其是可以有效排除非活性pri-miRNA与premiRNA前体的交叉杂交信号[7]。芯片筛选结果显示共有87种miRNA在结肠癌患者血清和正常人血清标本中有差异表达，其中上调表达有39个，下调表达有48个，差异均在1.5倍以上且差异具有统计学意义。通过查阅文献，在芯片筛选出的87种差异表达的miRNA中有12种与结肠癌的细胞分化、转移等相关[10]。用qRT-PCR对这12种miRNA进行验证。其中 miR-31、miR-141、miR-224-3p、miR-576-5p和miR-4669这5个miR分子在结肠癌症患者中的表达相对于正常对照组差异具有统计学意义。

随着分子生物技术的发展，与结肠癌有关的miRNAs陆续被人们发现。近年来有报道miR-31与结肠癌有着密切的关系[11-12]。YANG等[13]发现miR-31在结肠癌组织中高表达，发生淋巴结转移的结肠癌组织中miR-31的表达量高于未发生淋巴结转移的结肠癌组织。血液标本获取方便，对血清中miRNA进行检测从而诊断结肠癌及判断预后更适于临床的应用，可是目前有关miR-31在结肠癌血清中的报道并不多见。血清中miR-31表达量的增加提示miR-31可以作为潜在的肿瘤标记物，以miR-31为靶点的治疗将可能成为治疗结肠癌的另一重要手段。

miR-141属于miRNAs进化保守家族的一员，是具有上皮组织细胞特异性的微小RNA。miR-141作为miR200家族的成员之一，在结直肠癌、乳腺癌和前列腺癌中表达增高。目前对于结肠癌中miR-141表达的研究多见于结肠癌症组织和结肠癌细胞株，对于结肠癌血清中miR-141的报道很少[14]。检测结果提示miR-141在结肠癌患者血清中高表达。以手术切除结肠部位癌症组织的病理报告为金标准，血清miR-141诊断结肠癌的ROC曲线下面积为0.933，具有较好的诊断效能。

OLARU等[15]研究miRNA在正常→炎性肠病→结肠癌过程中的作用，发现miR-224在炎性肠病发展的各个阶段都表达上调，而且结肠癌中miR-224的表达水平高于正常黏膜和炎性肠病。进一步研究miR-224对结肠癌细胞生物学行为的影响，结果显示miR-224在细胞周期的调控中发挥了重要作用，其加快了G1期→S期的进程，并且发现这种调控作用是通过影响细胞周期调控因子p21实现的。在本文的芯片筛查结果中，miR-224-3p在结肠癌血清中表达倍数是正常人血清的5.4倍。后经过Real-time PCR验证，与芯片结果一致。

BALDEÓN等[16]发现，miR-576-5p在2型糖尿病患者的单核细胞中的表达水平升高。同时，他们还发现miR-576-5p与年龄有明显的联系，而miR-34c-5p并没有。miR-576-5p目前在癌症方面的研究较少。

朱桂璐等[17]对人乳腺癌BT474细胞及BT474/HER-2 siRNA细胞miRNAs表达谱结果分析，以BT474细胞为对照组，miR-4669在BT474/HER-2 siRNA细胞中表达下调，提示miR-4669在乳腺癌病情进展中可能与HER-2相关。目前miR-4669在结肠癌中的研究也很少。随着循环miRNA研究的深入，关于miR-576-3p，miR-4669在癌症方面的报道也会日益增多。

本研究分析了miR-31、miR-141、miR-224-3p、miR-576-5p和miR-4669新型miRNA循环分子标志物表达谱在结肠癌中的表达，5个miRNA联合起来组成的miRNA循环分子标记物表达谱在诊断结肠癌方面比单个miRNA分子的诊断效能更高。miRNA循环分子标志物表达谱有望成为应用于结肠癌患者临床诊治评估的重要指标。将结肠癌检查的不适度减至最轻，并提高检测的敏感性和特异性，为实现结肠癌的早期诊断，预后判断和延长结肠癌患者的生存时间，提高其生存质量。

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Detection of serum microRNA pro fi le in colon cancer and its clinical application value*

Ya-nan Wang1, Zhao-hua Chen2, Wei-chang Chen1
[1. The First Aff i liated Hospital of Soochow University, Suzhou, Jiangsu 215006, China;2. Suzhou Municipal Hospital (Suzhou Hospital Aff i liated to Nanjing Medical University), Suzhou, Jiangsu 215002, China]

ObjectiveTo explore the potential novel serum microRNA (miRNA) pro fi le in colon cancer and discuss its clinical application value.MethodsThe difference of serum miRNA expression between colon cancer patients and healthy people was detected by miRNA microarray chip technology. The differential expression of miRNAs in serum of 60 cases of colon cancer and 60 normal people were validated by qRT-PCR.ResultsA total of 87 miRNAs were differentially expressed in the serum of the colon cancer patients compared to the normal people, among which 39 miRNAs were upregulated and 48 miRNAs were down-regulated. miR-31, miR-141, miR-224-3p, miR-576-5p and miR-4669 expressions in the colon cancer patients were signi fi cantly different from those in the normal control group (P＜ 0.05). MicroRNA pro fi le (including miR-31, miR-141, miR-224-3p,miR-576-5p and miR-4669) has a higher efficiency in diagnosis of colon cancer (area under the ROC curve was 0.992).ConclusionsClinical detection of expression pro fi le of circulating molecular markers miR-31, miR-141,miR-224-3p, miR-576-5p and miR-4669 in colon cancer patients is useful for the diagnosis of colon cancer. It is expected to be an important index for evaluation of clinical diagnosis and treatment in patients with colon cancer.

colon cancer; serum microRNA; expression pro fi le

10.3969/j.issn.1005-8982.2018.01.008

1005-8982（2018）01-0037-07

2017-02-17

苏州市“科教兴卫”青年科技项目（No：KJXW2014017）

陈卫昌，E-mail：weichangchen@126.com；Tel：0512-67781310

R735.3

A

（张西倩 编辑）