孙文敬，杨 荔，栾 方，何小用，崔凤杰,*，王大明，钱静亚，齐向辉

变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸差向异构酶基因的原核表达

孙文敬1,2，杨 荔1，栾 方1，何小用1，崔凤杰1,2,*，王大明2,3，钱静亚1,2，齐向辉1

（1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；2.百勤异VC钠有限公司，江西 德兴 334221；
3.江南大学生物工程学院，江苏 无锡 214122）

采用降落聚合酶链式反应（touchdown polymerase chain reaction，TD-PCR）技术，从2-酮基葡萄糖酸工业生产菌株变形假单胞菌JUIM01中克隆了编码2-酮基葡萄糖酸差向异构酶的基因kguE。将目的基因与质粒pET-28a（＋）重组后转入宿主表达菌中，获得了重组菌株大肠杆菌BL21（DE3）/pET-28a（＋）-kguE。在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的诱导下，该重组菌株表达了一个分子质量约为30.5 ku的融合蛋白，且该蛋白的Western-blot鉴定结果显示为阳性。生物信息学分析结果表明，该蛋白是一种由256 个氨基酸残基组成的分子质量为28.5 ku的亲水性蛋白，与恶臭假单胞菌的2-酮基葡萄糖酸差向异构酶在氨基酸序列上的一致性达78%，定位于细胞质中，其二级结构中α-螺旋、延伸链和无规则卷曲所占的比例分别为40.62%、17.19%和42.19%。本研究结果为变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸差向异构酶的功能研究提供了一定理论支持。

变形假单胞菌；2-酮基葡萄糖酸差向异构酶；kguE基因；克隆；表达；生物信息学

2-酮基葡萄糖酸（2-ketogluconic acid，2KGA）即2-酮基-D-葡萄糖酸，是杂环化合物合成、区域选择性和立体选择性化学反应中的基础材料[1]，目前最主要的用途是作为食品抗氧化剂D-异抗坏血酸及其盐类合成的前体[2-5]。2KGA的生产方法主要有4 种，即化学合成法、酶法、发酵法和静息细胞转化法[6-8]。其中，发酵法是迄今为止最为经济、高效和环境友好的2KGA工业生产方法[9]。

氧化细菌[10-11]如假单胞菌（Pseudomonas）[12-13]、欧文氏菌（Erwinia）[14]、葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter）[15]、沙雷菌（Serratia）[16-18]、克雷伯菌（Klebsiella）[19-20]、醋酸杆菌（Acetobacter）[21]等，存在着由膜结合吡咯喹啉醌依赖的葡萄糖脱氢酶[22]和膜结合黄素腺嘌呤二核苷酸依赖的葡萄糖酸脱氢酶[23]组成的葡萄糖直接氧化系统，能够以葡萄糖为底物在细胞的周质空间中生物合成2KGA。在国内外2KGA的工业生产中，通常采用的菌株是具有相对高效、稳定发酵性能的假单胞菌[24]。

在假单胞菌的葡萄糖代谢中，随着培养条件的变化，积累于培养液中的中间代谢产物2KGA可以被转运至其细胞质内而被分解代谢[25]。相关研究结果[26-29]表明，与假单胞菌2KGA分解代谢相关的基因位于染色体上的2KGA利用操纵子即kgu操纵子中，并受到阻遏蛋白PtxS的调控，该蛋白同时调控其自身的合成。kgu操纵子包含kguT、kguK、kguE和kguD等结构基因，分别编码2KGA转运蛋白（2-ketogluconate transporter，KguT）、2KGA激酶（2-ketogluconate kinase，KguK）、2KGA差向异构酶（2-ketogluconate epimerase，KguE）和2KGA还原酶（2-ketogluconate reductase，KguD）。其中：KguT是一种跨膜转运蛋白，能够将周质空间或培养环境中的2KGA转运至细胞质中；KguK是一种ATP依赖性激酶，在ATP存在的条件下能够将2KGA磷酸化为2-酮基-6-磷酸葡萄糖酸；KguD是一种NADPH依赖性还原酶，能够将2-酮基-6-磷酸葡萄糖酸还原为中心代谢产物6-磷酸葡萄糖酸。利用基因敲除技术，Swanson等[26]证实了KguE是假单胞菌2KGA代谢过程中必不可少的一种异构酶，但到目前为止其在2KGA代谢中的作用尚未得到揭示，也鲜见到进一步的相关文献报道。为全面理解假单胞菌的2KGA代谢调控机制，有必要开展KguE功能的相关研究。

本研究以国内2KGA工业生产的主要用菌变形假单胞菌（P. plecoglossicida）JUIM01[30]为材料，利用降落聚合酶链式反应（touchdown-polymerase chain reaction，TD-PCR）克隆KguE的编码基因，原核表达带有His标签的KguE蛋白，并通过生物信息学方法分析和预测该蛋白的基本生物学特性，为后续的KguE蛋白纯化、鉴定及其结构与功能研究奠定基础，进而为2KGA的高效生产提供相关的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株和质粒

变形假单胞菌JUIM01，国内2KGA的工业生产用菌，由本实验室选育保藏；大肠杆菌（Escherichia coli）JM109、表达菌株大肠杆菌（E. coli）BL21（DE3）和表达质粒pET-28a（＋）由本实验室保存；克隆质粒pMD19-T购自宝生物工程（大连）公司。

1.1.2 培养基

LB培养基：酵母提取物5.0 g/L、胰蛋白胨10.0 g/L、NaCl 10.0 g/L，pH 7.0。

LB平板：含有15.0 g/L琼脂的LB培养基。

1.1.3 主要试剂和工具酶

琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）、细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型） 上海捷瑞生物工程有限公司；2×Pfu MasterMix 天根生化科技（北京）有限公司；SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、改良型Bradford法蛋白质浓度测定试剂盒、Anti-6×His antibody、Goat Anti-Rabbit IgG/HRP、W-TMB显色试剂盒、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG） 生工生物工程（上海）股份有限公司；限制性内切酶EcoRⅠ、限制性内切酶BamHⅠ、T4 DNA连接酶、DNA A-Tailing Kit、DL5 000 DNA Marker、Protein Molecular Weight Marker （Low）和5×Protein十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）Loading Buffer 宝生物工程（大连）公司；预染蛋白分子质量标准 碧云天生物技术研究所；考马斯亮蓝G250 国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

C1000 TouchTM型PCR仪、PowerPac Basic型电泳仪、GelDocTMXR＋型凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司；Eporator电转化仪、BioPhotometer plus核酸蛋白定量仪德国Eppendorf公司；DYCZ-40A型电泳仪 北京市六一仪器厂；UVG20型防紫外割胶仪 上海领成生物科技有限公司；QL-901型旋涡混合器、TS-2型脱色摇床 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；TGL-18M型冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；HYL-C型组合式摇床太仓市强乐实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 变形假单胞菌JUIM01基因组DNA的提取

挑取活化后的变形假单胞菌JUIM01单菌落，接种于5.0 mL的LB培养基中，30 ℃、200 r/min的条件下振荡培养12 h，然后离心（8 000 r/min，2 min）收集菌体，并用无菌水洗涤菌体2次。按照细菌基因组DNA提取试剂盒的操作方法，提取变形假单胞菌JUIM01的总DNA，并贮存于-20 ℃，备用。

1.3.2 PCR引物的设计与合成

根据本实验室在GenBank中公布的变形假单胞菌JUIM01的kgu操纵子的核苷酸序列（KU168040），结合生物信息学软件DNAMAN的分析结果，设计了PCR引物。为便于克隆与表达，在上、下游引物的5’端分别引入了BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。设计的PCR引物如下：

P1：5’-CGGGATCCATGCATGCGAACCCTGT-3’（BamHⅠ）

P2：5’-GGAATTCTCAGCCATGGTGGACCT-3’（EcoRⅠ）

1.3.3 变形假单胞菌kguE基因的扩增及测序

以设计的P1和P2为引物，以变形假单胞菌JUIM01的基因组DNA为模板，利用TD-PCR技术扩增kguE基因的全长序列。

PCR体系（50.0 μL）：2×Pfu MasterMix 25.0 μL，引物P1（10.0 μmol/L）1.0 μL，引物P2（10.0 μmol/L）1.0 μL，基因组DNA 1.0 μL，ddH2O 22.0 μL。

PCR程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，退火30 s（第1个循环的退火温度为75 ℃，以后每个循环降低1 ℃），72 ℃延伸1 min/kb，反应20个循环；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min/kb，反应25 个循环；72 ℃延伸5 min。

参照文献[30]所述的方法对PCR产物进行处理，然后提交生工生物工程（上海）股份有限公司进行DNA测序。

1.3.4 异源表达载体的构建与鉴定

利用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ分别对PCR产物和表达载体pET-28a（＋）进行双酶切处理；采用1%琼脂糖凝胶电泳分别纯化目的基因和表达载体的酶切产物；切胶获取二者的目标条带，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的DNA片段；在T4 DNA连接酶作用下，使回收的目的基因片段与线性化的表达载体pET-28a（＋）连接（16 ℃连接16 h），获得重组质粒pET-28a（＋）-kguE（图1）。

图1 重组质粒pET-28a（）-kguE的构建Fig. 1 Construction of the recombinant plasmid pET-28a(+)-kguE

将重组质粒pET-28a（＋）-kguE转入E. coli JM109的感受态细胞。取适量经转化的菌液涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板上，37 ℃培养12 h左右。从平板上挑取阳性单克隆，接种于含有50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，在30 ℃、200 r/min的条件下振荡培养12 h。利用质粒DNA提取试剂盒从扩大培养的阳性单克隆中提取重组质粒，然后进行质粒PCR验证、酶切验证和测序验证。

在翻转课堂的实践中，教师的角色不仅仅是课程内容的传授者，更多则转变为学习过程的引导者，学生则由原来被动的接受者，转变为积极主动的参与者[3]。

1.3.5 变形假单胞菌kguE基因的原核表达

将经过验证的重组质粒pET-28a（＋）-kguE导入E. coli BL21（DE3）的感受态细胞中，然后涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板上，37 ℃培养12 h。挑取阳性单克隆接种于含有50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min培养过夜。取上述培养物，按10%（体积分数）的比例接种于250 mL含有50 mL的LB培养基的锥形瓶中进行扩大培养。当培养液的OD600nm值达到0.5～0.8时，分别加入终浓度为0.6 mmol/L的IPTG，18 ℃、200 r/min的条件下诱导表达16 h。离心收集菌体，利用SDSPAGE及Western-blot对蛋白的表达情况进行检测。

1.3.6 表达产物的SDS-PAGE分析与Western-blot鉴定

取细胞培养液2.0 mL，离心（8 000 r/min，3 min）收集菌体，并用预冷的无菌PBS洗涤2次，然后使菌体重悬于200 μL的PBS中。取20.0 μL的重悬菌液与5.0 μL的上样缓冲液充分混匀，100 ℃煮沸5 min。冷却样品，对重组菌株的全细胞蛋白进行SDS-PAGE分析。

以预染蛋白质分子质量标准为Marker，以抗6×His单克隆兔抗（Anti-6×His antibody）为一抗、IgG/HRP羊抗兔（Goat Anti-Rabbit IgG/HRP）为二抗，对SDS-PAGE分离的KguE融合蛋白进行Western-blot鉴定。

1.3.7 变形假单胞菌KguE蛋白的序列分析

利用在线生物信息学分析工具对变形假单胞菌KguE蛋白的氨基酸序列进行分析[30]。

2 结果与分析

2.1 变形假单胞菌kguE基因的PCR扩增

以变形假单胞菌JUIM01的基因组为模板，以P1和P2为引物，按照设定的程序进行TD-PCR。取5.0 μL的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果（图2）显示：在750 bp附近有一条非常明显的条带，其大小与预计的kguE基因的大小相符，可初步认为已克隆到目的基因kguE。

图2 变形假单胞菌kguE基因PCR扩增产物的电泳分析Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplif i ed kguE gene from P. plecoglossicida

图3 变形假单胞菌KguE的基因序列及氨基酸序列Fig. 3 Nucleotide and amino acid sequences of KguE from P. plecoglossicide

采用DNA A-Tailing Kit对切胶回收的PCR产物加A尾后，使其与克隆载体pMD19-T连接，再经转化、蓝白斑筛选和质粒提取等步骤，得到了重组质粒pMD19-T-kguE。将验证正确的重组质粒送生工生物（上海）股份有限公司进行DNA测序，结果（图3）表明：克隆的kguE基因片段与本实验室克隆的变形假单胞菌kgu操纵子（GenBank：KU168040）中的kguE在核苷酸序列上是完全一致的，其核苷酸序列长度为771 bp。采用DNAMan软件分析发现，克隆的基因片段具有一个完整的开放阅读框，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。通过同源性比对发现，该基因片段与P. putida IEC33019、Pseudomonas sp. CCOS191、P. mosselii SJ10和P. putida S13.1.2等假单胞菌的kguE基因在核苷酸序列上的一致性达到75%～80%。

2.2 异源表达载体pET-28a（＋）-kguE的构建

将经过双酶切处理的变形假单胞菌kguE基因的PCR产物和质粒pET-28a（＋）连接，得到重组质粒pET-28a（＋）-kguE。将构建的重组质粒转入E. coli JM109的感受态细胞，然后对其阳性单克隆进行质粒PCR验证。从图4可以看出，以阳性单克隆的质粒DNA为模板、采用P1和P2为引物扩增的产物长度在750 bp左右，与预期的长度771 bp相符，可初步认为重组质粒得到正确构建。采用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ对重组质粒进行酶切验证，其结果（图5）与预期相符，因此可以认为目的片段已经准确插入表达载体，重组质粒得到成功构建。将经过验证的重组质粒送生工生物（上海）股份有限公司进行DNA测序，结果表明：重组质粒pET-28a（＋）-kguE的kguE与变形假单胞菌kgu操纵子（GenBank：KU168040）的kguE在核苷酸序列上是完全一致的。

图4 重组质粒pET-28a（）-kguE的kguE基因PCR扩增产物的电泳分析Fig. 4 Electrophoretic analysis of PCR ampli fi ed kguE gene from the recombinant plasmid pET-28a(+)-kguE

图5 重组质粒pET-28a（）-kguE酶切产物的电泳分析Fig. 5 Electrophoretic analysis of the restriction enzyme-digested products of recombinant plasmid pET-28a(+)-kguE

2.3 变形假单胞菌kguE基因在E. coli BL21（DE3）中的诱导表达

图6 重组菌株E. coli BL21（DE3）/pET-28a（）-kguE全细胞蛋白的SDS-PAGE分析Fig. 6 SDS-PAGE analysis of whole-cell proteins from E. coli BL21(DE3)/ pET-28a(+)-kguE

图7 重组菌株E. coli BL21（DE3）/pET-28a（）-kguE表达的融合蛋白的Western-blot分析Fig. 7 Western blot analysis of the fusion protein expressed by E. coli BL21(DE3)/ pET-28a(+)-kguE

从含有pET-28a（＋）-kguE的E. coli JM109中提取质粒pET-28a（＋）-kguE，然后将其转入E. coli BL21（DE3）。经抗性筛选和酶切验证后，得到重组菌株E.coli BL21（DE3）/pET-28a（＋）-kguE。在0.6 mmol/L的IPTG诱导下，18 ℃、200 r/min培养E. coli BL21（DE3）/pET-28a（＋）-kguE 16 h。离心收集菌体，利用SDSPAGE对变形假单胞菌kguE基因的原核表达情况进行检测。分析结果（图6）表明，E. coli BL21（DE3）/pET-28（＋）-kguE表达的带有His标签的重组蛋白的分子质量约为30.5 ku，与预测的变形假单胞菌KguE的分子质量相符，也与铜绿假单胞菌KguE的分子质量（28.9 ku）大致相符，而E. coli BL21（DE3）/pET-28a（＋）在相同的诱导条件下并不能表达出相同的蛋白。上述结果表明，变形假单胞菌基因kguE在E. coli BL21（DE3）中得到了成功表达。以抗6×his单克隆兔抗为一抗、IgG/HRP羊抗兔为二抗，对经SDS-PAGE分离的两种融合蛋白进行Western-blot检测，结果（图7）显示为阳性，进一步证明了目的基因的成功表达。

2.4 变形假单胞菌KguE蛋白序列的分析

利用ProtParam工具对变形假单胞菌KguE的基本理化性质进行了预测，结果表明：该蛋白由256 个氨基酸残基组成，其中带负电荷的氨基酸残基（Asp＋Glu）总数为35 个，带正电荷的氨基酸残基（Arg＋Lys）总数为25 个，其氨基酸组成（表略）中Ala和Leu居多，分别达到12.9%和13.7%。该蛋白的分子质量为28.5 ku，等电点为5.28，分子式为C1278H1988N364O370S7。变形假单胞菌KguE的不稳定指数为49.29（＞40），说明其在溶液中的性质不够稳定；该蛋白的脂溶性指数为93.83，总平均亲水性指数为-0.206，预测该蛋白属于亲水性蛋白。

采用PSORT Prediction、TMHMM Server 2.0和SignalP 4.1 Server等在线工具，分别对变形假单胞菌的细胞定位、跨膜结构和信号肽进行了预测，结果显示：该蛋白定位于细胞质中，无跨膜结构域，为非跨膜蛋白，而且没有信号肽的存在。

采用PredictProtein工具对变形假单胞菌KguE的二级结构进行了预测，结果表明：该蛋白的二级结构中包含α螺旋、延伸链和无规则卷曲3种结构形式，所占的比例分别为40.62%、17.19%和42.19%。

图8 KguE蛋白的系统进化树Fig. 8 Phylogenetic tree of KguE and KguE-related proteins

图9 变形假单胞菌JUIM01蛋白KguE的三级结构Fig. 9 Tertiary structure of KguE from P. plecoglossicida JUIM01 predicted by Swiss-model

利用BLAST工具从NCBI中数据库中获得与变形假单胞菌KguE同源性较高的氨基酸序列，并利用ClustW软件进行多序列同源性多重比对，采用MEGA 5.10软件对7 个不同来源的氨基酸序列进行系统进化分析。结果（图8）显示，变形假单胞菌KguE与恶臭假单胞菌KguE的同源性较高，其氨基酸序列的一致性达到78%。

利用蛋白质三级结构预测数据库Swiss-Model对变形假单胞菌KguE的三级结构进行预测。选取与KguE的氨基酸序列一致性为19.35%的D-木糖异构酶为模板，模拟KguE的三级结构。获取预测的蛋白质的三级结构后下载其PDB文件，然后利用蛋白质三级结构显示软件PyMOL进行处理与显示，结果如图9所示。

3 结 论

采用TD-PCR技术，从工业生产菌株变形假单胞菌JUIM01克隆了其kgu操纵子中的结构基因kguE，其核苷酸序列长度为771 bp，与P. putida IEC33019、Pseudomonas sp. CCOS191、P. mosselii SJ10和P. putida S13.1.2等假单胞菌的kguE基因在核苷酸序列上的一致性达到75%～80%。在T4 DNA连接酶的作用下，使经过双酶切处理的kguE基因与表达质粒pET-28a（＋）连接，构建了重组菌株E. coli BL21（DE3）/ pET-28a（＋）-kguE。在IPTG的诱导下，该重组菌株表达了分子质量约为30.5 ku的融合蛋白。SDS-PAGE分离的KguE融合蛋白的Westernblot鉴定结果显示为阳性，进一步证明了变形假单胞菌JUIM01的kguE基因在E. coli BL21（DE3）中的表达。

生物信息学分析结果表明：变形假单胞菌KguE是由256个氨基酸残基组成的无跨膜结构域的亲水性蛋白，理论分子质量为28.5 ku，定位于细胞质中。在该蛋白的二级结构中，α-螺旋、延伸链和无规则卷曲3 种结构形式所占的比例分别为40.62%、17.19%和42.19%。该蛋白与恶臭假单胞菌KguE的同源性较高，其氨基酸序列的一致性达78%。

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Prokaryotic Expression of a 2-Ketogluconate Epimerase Gene from Pseudomonas plecoglossicida

SUN Wenjing1,2, YANG Li1, LUAN Fang1, HE Xiaoyong1, CUI Fengjie1,2,*, WANG Daming2,3, QIAN Jingya1,2, QI Xianghui1
(1. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China;2. Parchn Sodium Isovitamin C Co. Ltd., Dexing 334221, China;3. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

The complete nucleotide sequence of the gene (kguE) encoding 2-ketogluconate epimerase was cloned by touchdown polymerase chain reaction (TD-PCR) from an industrial 2-ketogluconic acid producer, Pseudomonas plecoglossicida JUIM01. A recombinant vector was constructed by ligating the restriction enzymes digested products of the target gene to pET-28a(+) vector and then transferred into the expression host E. coli BL21(DE3). A specif i c fusion protein with molecular weight of about 30.5 ku was expressed in the recombinant strain E. coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-kguE after isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) induction with a positive Western-blot result. Bioinformatic analysis showed that the protein was predicted to be a hydrophilic protein with molecular weight of 28.5 ku located in the cytoplasm, sharing 78% amino acid sequence identity with the 2-ketogluconate epimerase from P. putida. The predicted secondary structure consisted of 40.62% of α-helix, 17.19% of extended strand and 42.19% of random coil. This study is expected to provide a basis for further elucidating the function of 2-ketogluconate epimerase in P. plecoglossicida.

Pseudomonas plecoglossicide; 2-ketegluconate epimerase (KguE); kguE gene; cloning; expression;bioinformatics

10.7506/spkx1002-6630-201802011

Q781

A

1002-6630（2018）02-0066-07

孙文敬, 杨荔, 栾方, 等. 变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸差向异构酶基因的原核表达[J]. 食品科学, 2018, 39(2): 66-72.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802011. http://www.spkx.net.cn

2017-02-25

国家自然科学基金面上项目（31571885）；国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2012AA022103）；

江西省科技计划项目（赣知发[2015]64号）；江西省创新团队建设计划项目（20142BCB24024）；

江西省科技平台建设计划项目（2010DTZ01900）；德兴市科技计划项目（德科发[2015]44号）

孙文敬（1964—），男，研究员，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：juswj@163.com

*通信作者简介：崔凤杰（1980—），男，教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：feijiecui@163.com

SUN Wenjing, YANG Li, LUAN Fang, et al. Prokaryotic expression of a 2-ketogluconate epimerase gene from Pseudomonas plecoglossicida[J]. Food Science, 2018, 39(2): 66-72. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201802011. http://www.spkx.net.cn