黄 峰,许元元

(皖北煤电集团总医院，安徽 宿州 234000)

·论著·

耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药基因检测及同源性

黄 峰,许元元

(皖北煤电集团总医院，安徽 宿州 234000)

目的探讨耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)耐药基因型及同源性。方法收集某院2015年9月—2016年2月临床标本分离的38株CRKP，采用聚合酶链反应(PCR)方法检测耐药基因型，脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析菌株同源性。结果38株CRKP主要来源于重症监护病房(ICU)及外科重症监护病房(SICU)，分别占39.48%、34.21%。38株CRKP均检出blaKPC和blaSHV耐药基因，6株检出blaCTX耐药基因。PFGE显示共分成A、B、C、D 4个谱型，其中以C型为主(65.78%，25/38)。A型菌株中菌株14、15、16携带blaKPC-2型、blaSHV型、blaCTX-M-15耐药基因，此3株细菌均是SICU患者分离的，菌株14和15分离自同一天，菌株16分离时间延后一周；C型菌株中，菌株10、18、25、28的同源性为100%，菌株10、18分离自ICU患者，菌株25、28分离自神经内一科患者(均从ICU转出)，均是在ICU住院期间检出，且分离时间相差1 d。结论该院CRKP耐药基因型以blaKPC及blaSHV为主，存在克隆株医院内流行。

耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌； 药基因型； 合酶链反应； 冲场凝胶电泳； 源性

近年来，由于抗菌药物的长期及不合理使用，导致肺炎克雷伯菌耐药菌株逐年增多[1]。碳青霉烯类抗生素主要包括亚胺培南、美罗培南、比阿培南、帕尼培南等，凭借其良好的抗菌活性，已成为临床上治疗多重耐药菌感染主要的抗菌药物之一[2]。但随着该类药物的广泛应用，目前耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)已在全球范围内出现并传播[3]，给临床抗感染治疗带来了极大困扰。我院近年来CRKP感染患者逐渐增多，本研究对我院收集的CRKP进行耐药基因型及同源性检测，同时结合病原菌相关信息进行分析，旨在了解我院肺炎克雷伯菌耐药基因携带情况以及同源性，为感染防控提供实验室依据。

1 资料与方法

1.1 菌株来源 收集皖北煤电集团总医院2015年9月—2016年2月临床标本分离的38株CRKP(排除同一患者重复分离株)，其中分离自血3株，痰32株，尿1株，深静脉导管2株。菌种鉴定按法国生物梅里埃Vitek 2 Compact 全自动细菌药敏分析仪及配套革兰阴性菌的鉴定卡(Vitek-GN)进行标准操作。质控菌株大肠埃希菌ATCC 25922购自卫生部临床检验中心。

1.2 仪器及试剂 Vitek 2 Compact 全自动细菌鉴定仪 (法国生物梅里埃公司)及配套革兰阴性菌的鉴定卡(Vitek-GN)。聚合酶链反应(PCR)扩增仪为PTC-200型PCR分析仪。PCR扩增试剂盒(Taq PCR Master Mix)、DNA Marker D、4S Red plus核酸染色剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司，所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。电泳仪为北京市六一仪器厂生产的DYY-6C型，美国Bio-rad 公司的凝胶成像系统。DNA测序仪器为ABI-PRISM 3730，测序试剂为BigDyeterminator v3.1，脉冲场电泳仪DR II (Bio-Rad)，凝胶成像仪(Gel DocTM XR+，Bio-Rad)。

1.3 耐药基因检测 水煮法提取细菌DNA模板，采用PCR方法扩增KPC、SME、NDM-1、IMP、VIM、SHV、CTX、OXA等耐药基因。反应体系为50 μL，Taq PCR Master Mix 25 μL,上、下游引物各2 μL，DNA模板1 μL，双蒸水20 μL。所测基因及其引物序列见表1，反应参数：预变性94℃ 10 min，变性95℃ 45 s,退火(每个基因温度略有不同，具体见表1)45 s,延伸72℃ 70 s，循环35个周期，最后72℃延伸10 min。扩增产物经含4S Red plus核酸染色剂的1.5%琼脂糖凝胶中电泳，使用美国Bio-rad 公司的凝胶成像系统(宿州市CDC提供)观察结果并照相。

表1 CRKP 耐药基因检测PCR引物序列及产物长度

1.4 测序及DNA序列分析 PCR扩增阳性产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序，测序结果在Genbank用BLAST与已知序列比较，以确定其基因型。

1.5 脉冲场凝胶电泳(PFGE) (1)细菌凝胶包埋：取新鲜营养琼脂培养物以TE缓冲液制成约4.0～4.2麦氏浊度单位的菌悬液，与1%的低熔点琼脂糖混合后灌注模具使之凝固，制成25 mm×10 mm×2 mm的凝胶包埋块。(2)细菌消化与裂解：将凝胶包埋块置5 mL细胞裂解液(CLB)中于54℃水浴摇床转速170 r/min裂解2 h，超纯水洗涤胶块2次，每次10 min，TE洗涤胶块4次，每次15 min，TE保存备用。(3)细菌染色体限制性酶切：从消化、裂解、洗涤好的凝胶包埋块上切下10 mm×2 mm×2 mm的小条凝胶，置于含 200 μL酶切缓冲液(M 缓冲液)的离心管中，缓冲5 min，吸弃缓冲液，加入新的M 缓冲液，再加入60 U限制性内切酶XbaI，37℃水浴中孵育2 h。(4)PFGE与图像获取：以0.5 × TBE置换酶切缓冲液，终止酶切。将酶切后的小条凝胶包埋于以0.5 × TBE配制的低熔点电泳凝胶中，充分凝固后将电泳凝胶置于脉冲场电泳槽内。如下设置电泳参数并启动电泳：电泳时间18.5 h，电压 6 V/cm、电场夹角 120°，电泳结束后将凝胶以EB染色30 min，然后纯水脱色2次，每次30 min，置成像仪紫外下拍照。(5)图谱分析：将Bionumerics (6.0版)分析条带位置。容忍度设为1%，优化度设为1.5%，以Dice系数计算图谱相似度，非加权平均数法(UPGMA)构建系统发育树。

2 结果

2.1 CRKP菌株科室分布 38株CRKP主要来源于重症监护病房(ICU)及外科重症监护病房(SICU)，分别占39.48%、34.21%。见表2。

表238株 CRKP科室分布及构成比

Table2Department distribution and constituent ratios of 38 strains of CRKP

科室株数构成比(%)ICU1539．48SICU1334．21神经外科25．26神经内一科410．53心内科25．26康复科12．63呼吸内科12．63合计38100．00

2.2 耐药基因检测结果 38株CRKP均检测出KPC和SHV耐药基因，检出率均为100.00%，6株检测出CTX耐药基因，检出率15.79%，未检测到SME、NDM-1、IMP、VIM、OXA耐药基因。见图1。

注：M分子量标志；1—3为KPC耐药基因阳性；4为阴性对照；5—7为SHV耐药基因阳性；8—10为CTX耐药基因阳性

图1CRKP耐药基因扩增产物电泳图

Figure1Electrophoresis map of amplification products of CRKP drug resistance genes

2.3 基因测序 在PCR扩增产物中任取3个阳性扩增产物送上海生工生物工程技术服务有限公司用ABI-PRISM 3730测序仪进行双向测序，测序结果经BLASTn(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTn)比对，与美国Genbank上已登录的基因号比对，分别证实为blaKPC-2型、blaSHV型、blaCTX-M-15型。

2.4 PFGE同源性分析 38株CRKP可分为A、B、C、D 4个谱型，其中以C型为主(65.78%，25/38)。菌株04、16、15、13、29、32、14为A型，Dice系数>90.00%，其中菌株16、15、14除携带KPC和SHV耐药基因外，还携带CTX耐药基因；菌株21、33、11为B型，Dice系数>92.00%，此3株细菌全部携带KPC、SHV和CTX耐药基因；菌株03、06、05、09、17、12、23、38、19、20、02、10、18、25、28、26、08、30、07、01、27、24、31、37、35为C型，此型菌株均携带KPC和SHV耐药基因，Dice系数>88.00%；菌株34、36、22为D型，Dice系数>95.00%，此型菌株均携带KPC和SHV耐药基因。见表3。A型菌株中14、15、16号菌携带blaKPC-2、blaSHV、blaCTX-M-15耐药基因，此3株细菌均是SICU患者分离的，菌株14和15分离自同一天，菌株16分离时间延后一周；C型菌株中，菌株10、18、25、28的同源性为100%，菌株10、18分离自ICU患者，菌株25、28分离自神经内一科患者(均从ICU转出)，均是在ICU住院期间检出，且分离时间相差1 d。各菌株的来源科室、部位及分离时间见图2。

表3 38株CRKP菌株PFGE分型结果

3 讨论

目前，人们认为肠杆菌科细菌对碳青霉烯类药物的主要耐药机制有三种：(1)青霉素结合蛋白对碳青霉烯类亲和力的改变；(2)AmpC酶过度表达及膜蛋白丢失；(3)碳青霉烯酶的产生[9]。其中最重要机制是碳青霉烯酶的产生[10-11]。碳青霉烯酶按照Ambler分子分类分为A、B、D三类：A类为丝氨酸蛋白质酶，分为KPC、GES、IMI/NMC-A、SME基因型；B类为金属酶，分为IMP、VIM、GIM、SPM、SIM、NDM-1基因型；D类为OXA酶，由blaOXA等位基因编码[12]。产碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯酶类抗生素耐药的主要机制之一，肺炎克雷伯菌几乎可以产生所有类型的β-内酰胺酶，SHV、OXA、CTX都属于β-内酰胺酶，但OXA系列，一般在肠杆菌科细菌中较少见。肺炎克雷伯菌产生的主要β-内酰胺酶之一是SHV酶，其水解头孢菌素能力强[13]。本研究中38株CRKP全部检出KPC和SHV耐药基因，检出率均为100.00%，得出的结论与前面学者观点一致，同时经测序后分别证实为blaKPC-2型及blaSHV型，另有6株CRKP同时还携带blaCTX-M-15耐药基因，说明CRKP的耐药机制十分复杂，也是导致临床治疗越来越困难的原因。

图2 38株CRKP的聚类分析图

本研究结果显示，本院CRKP主要由KPC碳青霉烯酶及β-内酰胺酶共同作用，增强了菌株的耐药性， 表现为多重耐药及泛耐药，同时存在着4种不同的谱型，并在ICU、SICU等科室流行，同时也暴露出本院感控工作存在不足，有待改进。有学者认为医院感染应重点关注耐药菌株的传播[15]。本次研究没能在耐药菌株暴发流行的时候对所在科室进行及时、全面检测，没能找出耐药菌株的传播途径，有待于进一步研究。有效控制多重耐药菌医院感染的重点在于预防控制措施的实施，因此，笔者认为一旦发现该类细菌出现，相关部门应及时采取有效的控制措施，加强科室内部环境及物品消毒，及时隔离相关患者，切实加强医护人员无菌操作技术，尤其是手卫生，控制传播途径，以减少医院内交叉感染，防止耐药菌蔓延。

[1] Tijet N，Sheth PM, Lastoovelska O, et al. Molecular characterization ofKlebsiellapneumoniaecarbapenemase(KPC)-producing Enterobacteriaceae in Ontario, Canada，2008-2011[J]. Plos One, 2014, 9(12): e116421.

[2] 林伯熹，李彬，刘秀琴，等 碳青霉烯类耐药阴沟肠杆菌耐药机制研究[J]. 中国感染与化疗杂志，2016，16(2),194-199.

[3] 孙晔佳，顾克菊.某院耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌检出与耐药表型分布[J].中国感染控制杂志，2017，16(2):130-133，137.

[4] 沈瀚，宁明哲，周万青，等. 亚胺培南不敏感大肠埃希菌碳青霉烯酶基因的检测[J]. 国际检验医学杂志，2013,34(6):643-644，646.

[5] Yong D, Toleman MA, Giske CG, et al. Characterization of a new metallo-beta-lactamase gene, bla(NDM-1), and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure inKlebsiellapneumoniaesequence type 14 from India[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2009, 53(12): 5046-5054.

[6] 卢焕，玉艳红，覃金爱，等. 耐碳青霉烯类鲍氏不动杆菌金属β-内酰胺酶检测与同源性分析[J]. 中华医院感染学杂志，2015,25(2):282-284.

[7] 刘淑敏，许云敏，牛敏，等. 急诊重症监护病房耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的分子流行特征[J]. 中国感染与化疗杂志，2015，15(4):372-376.

[8] Poirel L, Walsh TR, Cuvillier V, et al. Multiplex PCR for detection of acquired carbapenemase genes[J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 2011, 70(1): 119-123.

[9] 陈捷，朱立军，李万翔. 肠杆菌科细菌碳青霉烯酶基因的检测[J].中国微生态学杂志，2016，28(7):825-827.

[10] Walther-Rasmussen J, Hφiby N. Class A carbapenemases[J]. J Antimicrob Chemother, 2007, 60(3): 470-482.

[11] Queenan AM, Bush K. Carbapenemases: the versatile β-lactamases[J]. Clin Microbiol Rev, 2007, 20(3): 440-458.

[12] 杨莉，张红岩.碳青霉烯酶基因型的研究进展[J].中国微生态学杂志，2014,26(3):366-368.

[13] 张伟铮，何慧婵，许振杰，等.耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的基因型及同源性分析[J].临床检验杂志，2015,33(5):391-394.

[14] 孙康德，陈旭，虞中敏，等.碳青霉烯类耐药克雷伯菌属细菌的药物敏感性及同源性分析[J].检验医学，2014,29(11):1136-1140.

[15] 张筠，邓在春，马红映，等.耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的耐药机制及同源性分析[J].中国现代医生，2015,53(27):16-19.

Detectionofdrugresistancegenesandhomologyofcarbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae

HUANGFeng,XUYuan-yuan

(GeneralHospitalofWanbeiCoal-ElectricityGroup,Suzhou234000,China)

ObjectiveTo explore the drug-resistant genotypes and homology of carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae(CRKP).Methods38 strains of clinically isolated CRKB in a hospital between September 2015 and February 2016 were collected, drug resistance genes were detected with polymerase chain reaction (PCR), homology of strains was analyzed with pulsed-field gel electrophoresis (PFGE).ResultsAll 38 strains were from intensive care unit(ICU) and surgical intensive care unit(SICU), accounting for 39.48% and 34.21% respectively. 38 strains all harboured drug resistance genes blaKPCand blaSHV, 6 strains harboured blaCTX. PFGE revealed that strains were divided into types A, B, C, and D, type C was predominant(65.78%，25/38). Of type A strains, strains 14, 15, and 16 carried drug resistance genes blaKPC-2, blaSHV, and blaCTX-M-15respectively, these strains were all isolated from SICU patients, strains 14 and 15 were isolated on the same day, strain 16 was isolated on the following week; of type C strains, homology of strain 10, 18, 25, and 28 was 100%. strian 10 and 18 were isolated from ICU patients, strains 25 and 28 were isolated from patients in division I of neurology ICU( both were transferred from ICU), and both were isolated during patient hospitalization in ICU, the isolation time only differed for one day.ConclusionThe main drug-resistant genotypes of CRKB in this hospital are mainly blaKPCand blaSHV, there is epidemic of clone strains in this hospital.

carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae；drug-resistant genotype；polymerase chain reaction; pulsed-field gel electrophoresis; homology

[Chin J Infect Control，2018，17(1)：21-25]

2017-03-26

蚌埠医学院科研课题项目(BYKY16170)

黄峰(1975-)，男(汉族)，安徽省濉溪县人，副主任技师，主要从事微生物耐药机制研究。

黄峰 E-mail：huangfeng508@126.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2018.01.005

R181.3+2 R378.99

A

1671-9638(2018)01-0021-05

文细毛)