陈文明，蹇明辉，赵永超，龙禹哲，刘围围，龙仙萍，石 蓓

(遵义医学院附属医院 心血管内科，贵州 遵义 563099)

基础医学研究

Toll样受体4通过PI3K/Akt信号通路调节骨髓间充质干细胞凋亡

陈文明，蹇明辉，赵永超，龙禹哲，刘围围，龙仙萍，石 蓓

(遵义医学院附属医院 心血管内科，贵州 遵义 563099)

目的研究Toll样受体4(TLR4) 对骨髓间充质干细胞 (MSCs) 凋亡的影响及其可能的机制。方法本实验运用脂多糖(LPS)作用于的大鼠MSCs，应用流式细胞术鉴定MSCs；实验分成4组：对照组、LPS组、TLR4阻断剂+LPS组、LY294002+LPS组，缺氧处理6h后，用Western blot法检测TLR4、p-Akt、Akt、Bax、Bcl2、Caspase-3蛋白的表达变化；流式细胞术检测细胞凋亡率。结果与对照组比较，LPS作用后TLR4的表达明显上调(P<0.01)，p-Akt表达增加，Bax表达降低，Bcl-2的表达上升，Caspase-3表达减少，且MSCs的凋亡率也减少(P<0.05)；TLR4阻断剂处理后p-Akt较LPS组减少，Bax表达上调，Bcl-2的表达下降，Caspase-3表达增加，MSCs的凋亡率也增加(P<0.01)，LY294002预处理后p-Akt表达较LPS组明显降低，Bax表达显著上调，Bcl-2的表达下降，Caspase-3表达明显增加，且MSCs的凋亡率也增加(P<0.01)。结论TLR4对MSCs的凋亡具有抑制作用，其作用机制可能与激活IP3K/Akt信号通路，继而抑制Caspase-3活性有关。

Toll样受体4；PI3K/Akt信号通路；骨髓间充质干细胞；细胞凋亡

心肌梗死(Myocardial Infarction，MI)是临床常见的危重症，严重威胁着人类生命和健康。近年来，骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)治疗心肌梗死，已成为心血管领域的研究热点[1]。然而在心肌局部组织缺血、缺氧等微环境和早期炎性反应均不利于移植MSCs的存活[2]。Toll样受体4(Toll-like receptors 4，TLR4)是抵御病原体入侵的先天免疫和特异性免疫必不可少的介质，TLR4除了可引发炎症反应，还可以直接调控细胞增殖和细胞存活[3]。有研究报道，激活的TLR4能影响MSCs的生存、分化、增殖，但其作用机制尚不明确[4]。因此本研究拟采用脂多糖(LPS)刺激 MSCs，初步探讨 TLR4能否通过调节MSCs 凋亡的作用，提高移植细胞的成活，为MSCs治疗心肌梗死提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级4周龄SD大鼠，雌雄不限，重50～100 g，由中国人民解放军第三军医大学大坪医院动物中心提供[许可证号SCXK(渝)2012-0005]。

1.2 主要试剂与仪器 脂多糖(美国美国SIGMA-ALDRICH公司)、TLR4阻断剂(TLR4 antibody)(美国Abcam)、AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)、兔抗小鼠TLR4多克隆抗体(美国SANTA CRUZ公司)、兔抗小鼠p-Akt 多克隆抗体(美国SANTA CRUZ公司)、兔抗小鼠Akt 多克隆抗体(美国SANTA CRUZ公司)、兔抗小鼠Akt多克隆抗体(美国SANTA CRUZ公司)、兔抗小鼠Bcl-2多克隆抗体(美国SANTA CRUZ公司)、兔抗小鼠Caspase-3多克隆抗体(美国SANTA CRUZ公司)、兔抗小鼠Bax多克隆抗体(美国SANTA CRUZ公司)、兔抗小鼠β-Actin多克隆抗体(美国SANTA CRUZ公司)、PI3K特异性抑制剂LY294002(美国SIGMA-ALDRICH公司)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物公司)、流式细胞计数仪FACS Calibur(美国Becton-Dickinson)、倒置荧光显微镜(日本 OLYMPUS)、电泳仪(美国BIO-RAD) 。

1.3 MSCs的培养和鉴定 SD大鼠断颈处死，用酒精浸泡消毒，在无菌条件下分离股骨和胫骨，冲出骨髓，离心，弃上清，制成单细胞悬液，转移到细胞培养瓶，将细胞培养瓶置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养，细胞培养至第3代用于实验，用流式细胞仪检测骨髓MSCs表面标记物[5]。

1.4 实验分组和细胞损伤模型的制备 实验分成4组，对照组：PBS溶液；LPS 组：1.0μg/mL LPS培养72 h；TLR4阻断剂+LPS组：Anti-TLR4 (0.5 μg/mL)预处理 2 h，再加入LPS(1.0 μg/mL)培养72 h，LY294002 + LPS组：LY294002 (10 μmol/L)预处理2 h，再加入LPS(1.0 μg/mL)培养72 h。以PBS冲洗，更换培养基为无血清、无糖的改良蒂罗德溶液，将实验各组置于含体积分数为0.01的O2、体积分数为0.05的CO2和体积分数为0.94的N2的三气培养箱中培养，进行缺氧处理6 h。

1.5 Western blot法检测实验各组TLR4、p-Akt、Akt、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达 缺氧处理6 h后，将各试验组MSCs收集后离心，按每2×106个细胞加入100 μL RIPA裂解液+1 μL PMSF，裂解，离心，留取上清液，用BCA法检测蛋白浓度。配胶上样，恒压电泳后转膜(湿转)，将PVDF膜放入封闭液中，摇床震荡孵育2h，TBST洗膜。与一抗结合(兔抗小鼠TLR4 1∶200、兔抗小鼠p-Akt 1∶200、兔抗小鼠Akt 1∶200、兔抗小鼠Caspase-3 1∶200、兔抗小鼠Bcl2 1∶200、兔抗小鼠Bax 1∶200、兔抗小鼠β-actin 1∶200)，4 ℃过夜。洗膜，二抗孵育(羊抗兔多克隆抗体IgG 1∶5 000，室温下避光孵育2 h)，洗膜，加显色液，在BIO-RAD凝胶成像仪中曝光。结果采用Quantity One定量分析软件进行分析，目的条带与内参照β-actin 的灰度值比值作为半定量依据。

1.6 流式细胞术检测MSCs的凋亡率 待细胞缺氧 6 h 后，消化收集细胞，PBS液洗涤2～3遍，1 000 rpm离心 5 min，每管加入200μL的Binding Buffer悬浮细胞，加入3～5 μL Annexin V-FITC混匀后，加入5 μL Propidium Iodide(PI)，混匀，室温避光反应15 min。另设三管对照，分别为空白细胞管、仅加Annexin V-FITC管及仅加PI管；1 h内上机进行流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 MSCs的培养与鉴定 倒置显微镜下观察到，第三代MSC细胞形态一致，呈长梭状，且分布均匀(见图1)。经流式细胞仪鉴定表明：MSCs表面抗原的表达情况为：CD29 99.6%，CD90 99.7%，CD45 2.3 %(见图2)。

图1 MSCs生长情况(100×)

图2 流式细胞术鉴定第3代MSCs细胞表面标记物

2.2 缺氧处理后MSCs中TLR4表达情况 Western blot法检测结果发现，MSCs缺氧处理6 h后，LPS组TLR4蛋白的表达明显上调(P<0.01)，说明LPS可有效上调TLR4蛋白的表达水平。见图3。

*P<0.01,与对照组比较；△P<0.01与LPS组比较。图3 LPS处理后各组MSCs中TLR4蛋白表达

2.3 缺氧处理后MSCs中p-Akt、Akt、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表达 与对照组比较，LPS组的p-Akt、Bcl-2表达显著增加，而Bax、Caspase-3表达明显减少(P均<0.01)。与LPS组比较，TLR4阻断剂+LPS组和LY294002+LPS组的p-Akt和Bcl-2的表达降低(P均<0.01)，但Bax和Caspase-3表达增加(P均<0.01)(见图4、5)。

*P<0.01，与对照组比较；△P<0.01，与LPS组比较 。图4 各组MSCs中的p-Akt表达

2.4 缺氧处理后MSCs的凋亡率 流式细胞仪检测结果显示：与对照组比较，LPS组细胞凋亡率降低(P<0.01)；与LPS组比较，TLR4阻断剂+LPS组细胞凋亡率增加(P<0.01)，LY294002+LPS组细胞凋亡率明显升高(P<0.01)(见图6)。

3 讨论

TLR4在动脉粥样硬化和心力衰竭等心血管系统疾病的发生、发展过程中起着重要的作用。TLR4的内源性配体热休克蛋白(heat shock protein，HSP )和外源性配体LPS均可以激活TLR4信号通路，TLR4的激活可以导致髓样分化蛋白(myeloid differentiation protein，MyD )-88-NF-KB信号通路活化，促进细胞增殖[6-7]。骨髓问充质干细胞是来源于骨髓、具有自我更新和多向分化潜能的非造血干细胞。近期研究表明 TLR4 不但在MSCs表面表达，并且TLR4在促进MSCs更新方面可能起到较为重要的作用[8]。

心肌梗死发生后，心肌组织血液供应减少或阻断，导致缺血部位的心肌细胞死亡，引起心肌功能受损[9]。MSCs具备多向分化潜力，可向多种组织细胞分化，因此，MSC被广泛用于心肌梗死治疗的研究[10]。但是移植的MSC在炎症因子刺激或低氧的条件下，导致细胞的增殖减慢、凋亡增加，限制了MSCs 移植的效率[11]。因此，提高MSCs移植效率对治疗心肌梗死疾病具有重要的研究价值。

本研究在模拟梗死心肌区域缺血缺氧的条件下，用流式细胞仪检测发现LPS处理MSCs后细胞凋亡率明显减少，用TLR4阻断剂处理后MSCs凋亡率明显增加，证实TLR4参与了MSCs的凋亡。PI3K/AKT信号转导通路对于调节细胞的生长、增殖、自噬以及凋亡有着重要的作用。Akt是细胞内重要的促存活因子，是PI3K的下游作用底物，当磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(Phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate，PIP3)作用于下游信号分子Akt，使其从细胞质转移到细胞膜上，此时，激活的Akt通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白GSK3-β、mTOR，Bcl-2蛋白家族和caspase-3，进而调节细胞的增殖、分化、凋亡[12-14]。有研究报道， LPS剌激结肠癌细胞的TLR4受体时，PI3K/Akt信号通路被显著激活且结肠癌细胞转移和浸润程度加重，提示PI3K/Akt信号通路在肿瘤细胞的生成、增殖和转移的过程中发挥重要作用，且通过抑制肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤细胞生存[15]。PI3K/AKT信号转导通路能促进骨髓间充质干细胞增殖[16]。LPS预处理后，提高MSCs移植率，增加心脏新血管密度、降低大鼠心肌梗死后体内炎症水平[17]。为证明缺血缺氧条件下的MSCs通过TLR4-PI3K-Akt信号通路激活而抑制细胞凋亡，进一步通过添加TLR4阻断剂和PI3K/Akt的抑制剂LY294002加以验证。结果发现，LPS处理MSCs后p-Akt磷酸化水平明显提高，然而用TLR4阻断剂处理后p-Akt磷酸化水平明显下降，LY294002处理后p-Akt磷酸化水平也明显下降，证实LPS能激活TLR4-PI3K-Akt信号通路，抑制MSCs凋亡。

进一步研究TLR4-PI3K-Akt信号通路在MSCs中的作用，通过western blot法检测各组中Bax、Bcl-2和Caspase-3的表达，结果发现，LPS处理MSCs后Bax和Bcl-2的蛋白表达率(Bax/Bcl-2)<1，Caspase-3表达也同时减少，用TLR4阻断剂处理MSCs后Bax/Bcl-2和Caspase-3表达明显增加，同时，LY294002组Bax/Bcl-2和Caspase-3表达也明显增加。

综上所述，TLR4抑制MSCs的凋亡，其作用机制可能与激活PI3K/Akt信号通路，调节Bax、Bcl-2和Caspase-3活性有关。

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[收稿2017-10-11;修回2017-11-10]

(编辑：谭秀荣)

Toll-likereceptor4regulatsapoptosisofbonemarrowmesenchymalstemcellsthroughPI3K/Aktsignalingpathways

ChenWenming，JianMinghui，ZhaoYongchao，LongYunzhe，LiuWeiwei，LongXianping，ShiBei

(Deparment of Cardiology， Affiliated Hospital of Zunyi Medical University，Zunyi Guizhou 563099,China)

ObjectiveTo study the effect the toll-like receptor 4(TLR4) on apoptosis of bone marrow mesenchymal stem cells and mechanisms.MethodsMSCs were culturedinvitro.Flow cytometry was used to identify MSCs.The experiment was divided into four groups:control group,LPS group,LPS + TLR4 blockers group,LPS + LY294002group,treated with hypoxia for 6h.The protein expression of TLR4,p-Akt,Akt,Bax,Bcl2,Caspase-3 was detected by Western blot.Cell apoptosis rate was detected flow cytometry.ResultsCompared to the control group,cell apoptosis rate was significantly decreased in LPS group (P<0.01).LPS treatment increased the expression of p-Akt and Bcl-2 in MSCs (P<0.01),decreased the expression of Bax and caspase-3(P<0.05).Compared to the LPS group,TLR4 blockers and LY294002 decreased the apoptosis rate of MSCs and the expression of p-Akt and Bcl-2,increased Bax and Caspase-3 level (P<0.05).ConclusionTLR4 inhibits apoptosis of MSCs,and its mechanism may be related to activation of PI3K/Akt signal pathway and then inhibition of Caspase-3 activity.

Toll-like receptor 4；PI3K/Akt signaling pathway；bone marrow mesenchymal stem cells；cell apoptosis

贵州省国际科技合作计划项目(NO：黔科合外G字[2011]7018)。

石蓓，女，硕士，教授，硕士生导师，研究方向：干细胞介入治疗心血管疾病，E-mail：shibei2147@163.com。

R541.4

A

1000-2715(2017)06-0617-05