何 欣，马洋帆，赵红霞，聂晓静

(大连理工大学 环境学院，工业生态与环境工程教育部重点实验室，辽宁 大连 116024)

固相萃取/高效液相色谱-串联质谱法同时检测环境水样中24种农药残留

何 欣*，马洋帆，赵红霞，聂晓静

(大连理工大学 环境学院，工业生态与环境工程教育部重点实验室，辽宁 大连 116024)

建立了一种固相萃取/高效液相色谱-串联质谱(SPE/HPLC-MS/MS)同时检测水体中24种农药的分析方法。样品用乙腈提取后，经固相萃取小柱富集净化。以乙腈-0.1%(体积分数)甲酸水溶液为流动相梯度洗脱，在电喷雾离子源正离子模式下(ESI+)采用多反应监测(MRM)模式检测。结果显示，24种农药在1～200 μg/L范围内具有良好的线性关系，相关系数(r2)均不小于0.998，水样中3个添加水平(5、20、100 μg/L)下的回收率为65.9%～127.8%，相对标准偏差(RSD)为0.7%～14.2%；方法检出限为0.05～0.71 ng/L。采用该方法对大连地区10个河流入海口及2个水库的水样进行了检测，12个站位的样品中共检出10种农药，质量浓度为0.2～558.3 ng/L。结果表明，所建立的SPE/HPLC-MS/MS方法高效、灵敏、可靠，可用于实际水体中多种农药的同时检测。

固相萃取；高效液相色谱-串联质谱；农药；水样检测

农药因可以灭杀昆虫、真菌和其他危害农作物生长的生物而广泛用于世界各国[1]。现代农业科学的不断发展，使得越来越多种类的农药应用于农作物中，在提高农作物产量的同时，也对环境产生了巨大的危害，其所产生的污染成为我国影响范围最大的一种有机污染[2]。我国的农药利用率低，大部分农药会残留在环境中，通过降水、地表径流、土壤淋溶等途径进入水体，从而破坏水生生态系统的平衡，特别是农田附近的河流和湖泊污染严重，鱼类死亡率高，甚至引起人类的健康问题。

由于环境基质复杂多变，故对建立同时检测环境中多种农药残留的方法要求较高。目前，农药的检测方法主要是液液萃取、固相萃取和固相微萃取等前处理方法结合色谱分析技术，如气相色谱-质谱(GC-MS)[3-4]、气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)[5]、高效液相色谱(HPLC)[6-7]、高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)[8-9]、高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)[10-11]、超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)[12-13]等。多反应监测模式的HPLC-MS/MS因具有特异性强、灵敏度高、线性动态范围宽等特点，而被广泛用于农药的检测[14-17]。

国内对农药残留的分析局限于农作物和土壤，目前已报道的水体中快速、高效的农药检测方法有限，且所检测农药的种类较少。江阳等[18]分析了饮用水中13种农药的残留情况，简化了样品前处理的过程，但杂质干扰较大，检出限较高，不能满足更低残留量的检出要求。闫凤丽等[19]检测了环境水体中6种磺酰脲类除草剂残留，前处理采用固相膜萃取，易于堵塞，传质阻力较大，检出限较高，并且单一的液相色谱分析技术灵敏度较低，选择性较差，不能满足复杂水体中多种类农药的同时检测需求，因此对水体中多种类农药高效准确分析方法的开发尤为重要。

本研究采用SPE/HPLC-MS/MS技术，建立了水体中13种磺酰脲类除草剂、3种酰胺类除草剂、3种新烟碱类杀虫剂和其他5种农药同时测定的分析方法。经过SPE前处理技术，水样富集倍数高，可用于实际水样中微量农药的残留分析，并且对固相萃取小柱、洗脱溶剂、上样pH值等前处理的实验条件进行了优化。该方法成功应用于实际10个河流入海口及2个水库水样中目标农药残留的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

液相色谱：Agilent 2100 SL，安捷伦科技有限公司；质谱：Agilent 6410B 三重四极杆串联质谱仪，安捷伦科技有限公司；色谱柱：Xterra®MS C18(3.5 μm,2.1 mm×100 mm)，沃特世科技(上海)有限公司；真空固相萃取装置：12管防交叉污染型，Supelco公司。乙腈(色谱纯，Sigma-Aldrich公司)；甲醇(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；甲酸(分析纯，天津天河化学试剂厂)；超纯水(18.2 MΩ·cm,Milli-Q Water公司)。

标准品：噻吩磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、醚苯磺隆、氯磺隆、酰嘧磺隆、三氟啶磺隆钠盐、甲磺胺磺隆、烟嘧磺隆、苄嘧磺隆、吡嘧磺隆、氯吡嘧磺隆、氟胺磺隆、扑草净、嗪草酮、噻虫啉、氯噻啉、氟虫腈、除草定、噻虫嗪、异丙甲草胺、乙草胺、丁草胺、丙环唑，均购自北京百灵威科技有限公司，纯度均高于98%。

1.2 液相色谱-质谱/质谱分析条件

液相色谱条件：Waters Xterra MS C18(3.5 μm,2.1 mm×100 mm)色谱柱，流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈，流速0.25 mL/min，洗脱梯度程序：0～10 min，25%B；10～15 min，25%～50%B；15～20 min，50%～60%B；20 min后，100%B。

质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描模式，干燥气温度为350 ℃，干燥气流速为8 L/min，毛细管电压为4 000 V，电喷雾压力为25 psi。

1.3 样品前处理

水样经0.45 μm玻璃纤维滤膜过滤，用量筒准确量取500 mL于棕色玻璃瓶中，用盐酸调至pH 3.5，随后进行固相萃取。首先分别用10 mL乙腈、超纯水和pH 3.5的超纯水活化小柱，然后导入水样，控制流速为5 mL/min。用pH 3.5的超纯水冲洗瓶子和柱子，并在真空条件下抽干。用10 mL乙腈对固相萃取柱进行洗脱，使其在重力作用下，自由滴落，在水浴氮吹仪上氮吹至近干，然后用0.1%甲酸水-乙腈溶液(8∶2)定容至500 μL于液相小瓶中，涡旋待测。

2 结果与讨论

2.1 仪器条件优化

2.1.1质谱条件优化将储备液稀释至20 μg/L后，对其质谱条件进行优化。采用全扫描模式(Scan)确定目标物的母离子；采用选择离子扫描模式(SIM)，优化碎裂电压(Fragmentor)；在子离子扫描模式(Product ion)下，确定碎片离子；在多重反应监测模式(MRM)下，优化碰撞能量(CE)。通过优化得到的母离子、子离子、去簇电压和碰撞能量如表1所示。

表1 24种农药的质谱检测参数Table 1 MS detection parameters of the 24 pesticides

*quantitative ion;CE:collision energy

图1 24种农药标准样品的色谱图Fig.1 HPLC-MS/MS chromatogram of the 24 pesticides standards1.thiamethoxam;2.imidaclothiz;3.thiacloprid;4.bromacil;5.nicosulfuron;6.metribuzin;7.thifensulfuron-methyl;8.prometryn;9.metsulfuron-methyl;10.sulfometuron-methyl;11.triasulfuron;12.chlorsulfuron;13.amidosulfuron;14.trifloxysulfuron-sodium;15.mesosulfuron-methyl;16.bensulfuron-methyl;17.pyrazosulfuron-ethyl;18.halosulfuron-methyl;19.triflulsulfuron-methyl;20.metolachlor;21.acetochlor;22.propiconazole;23.fipronil;24.butachlor

2.1.2流动相优化由于实验采用ESI+模式，而酸性条件一般可提高[M+H]+化合物的正离子响应，因此选用酸性流动相，可以加强离子化效率，从而提高检测灵敏度[20]，所以在水相中添加甲酸来增强农药的分离度。实验考察了0.1%甲酸水溶液、0.2%甲酸水溶液、0.3%甲酸水溶液分别与甲醇、乙腈为流动相时对分离效果和质谱响应的影响。结果表明，当有机相为乙腈，水相为0.1%的甲酸水溶液时，24种农药在出峰位置和峰形一致的情况下具有更大的峰面积，因此采用乙腈为有机相，0.1%的甲酸水溶液作为水相。

由于所分析的目标物种类较多，为缩短仪器的分析周期，提高仪器的分析能力，选择合适的洗脱梯度至关重要。实验中不断优化有机相与水相的配比，最终得到24种农药标准样品在100 μg/L质量浓度下的总离子流图如图1所示。

2.2 前处理方法优化

环境水体的基底复杂，且农药残留浓度一般较低，为去除基底干扰以及提高农药检测的灵敏度，需对样品进行前处理。由于固相萃取(SPE)具有回收率高、富集倍数高、萃取时间短以及有机溶剂用量少等优点，被广泛应用于样品预处理[21-23]。

2.2.1固相萃取柱的优化考察了Sep-Pak C18和Oasis HLB两种固相萃取小柱在100 μg/L加标水平下对24种农药的富集和回收效果，3组平行实验的结果如图2所示。对于大部分农药来说，两种SPE柱差别较小，但噻虫嗪、甲磺隆、氯磺隆、氟胺磺隆、丁草胺在C18柱的回收率较低，分别为19.02%、52.67%、55.75%、60.71%、44.82%；在HLB柱的回收率为82.3%～108.1%，且重现性较好。因此，本方法采用Oasis HLB作为SPE小柱。

图2 不同固相萃取柱对24种农药净化效果的比较Fig.2 Comparison of the clean-up effects of different SPE cartridges for 24 target pesticides

2.2.2洗脱溶剂的优化洗脱剂的组成在SPE萃取过程中决定着分析物是否被完全洗脱，从而影响分析物的回收率[24]。实验比较了洗脱溶剂体积(6、8、10、12 mL)对回收率的影响，结果发现洗脱溶剂的体积为10 mL时，目标物的回收率最优。其次，考察了乙腈和甲醇两种洗脱溶剂在100 μg/L加标水平下对24种农药回收率的影响，进行3组平行实验。当用乙腈作为洗脱溶剂时，得到22种农药的回收率为82.3%～108.1%，甲嘧磺隆的回收率为127.8%，丁草胺的回收率为68.8%；而用甲醇作为洗脱溶剂时，异丙甲草胺、乙草胺、丁草胺和噻吩磺隆的回收率较低，分别为54.07%、47.55%、37.95%、62.75%。相对于甲醇来说，乙腈作为洗脱溶剂时3个平行实验的相对标准偏差(RSD)为0.7%～11.7%，比较稳定。因此，本方法采用乙腈作为固相萃取的洗脱溶剂。

2.2.3洗脱溶剂的优化水样的酸碱性可影响农药在水中存在的状态(离子态、分子态)、稳定性以及与固相萃取小柱填料的相互作用[25]，从而影响目标物的回收率。由于本方法所选的农药大部分为弱酸性，因此选用酸性的水样环境更利于农药的富集。实验中采用盐酸将水样的pH值分别调至2.5、3.5、4.5，每组平行3次。结果发现，当上样的pH值为3.5时，24种农药的回收率普遍较优，并且3次平行实验的RSD相对稳定。因此，本方法选择将水样调至pH 3.5后上样。

2.3 标准曲线、检出限

实验中配制2、5、10、20、50、100 μg/L质量浓度的标准工作溶液，绘制标准曲线。由于扑草净和异丙甲草胺的检出限较高，氟虫腈的检出限较低，因此绘制扑草净和异丙甲草胺的标准曲线时，其浓度梯度为其他21种农药的1/2；氟虫腈为其他21种农药浓度的2倍。以各目标物色谱峰的信噪比(S/N)等于3来确定仪器的检出限(IDL)，方法的检出限(MDL)换算为浓缩1 000 倍前水样中可检出的目标物质量浓度(ng/L)。24种农药的线性关系、IDL和MDL见表2。结果表明，24种农药的线性相关系数(r2)均不小于0.998，方法检出限为0.05～0.71 ng/L，该方法的线性范围好，检出限低，灵敏度高。

表2 24种农药的线性关系、仪器检出限和方法检出限Table 2 Linear relationship,IDLs and MDLs of the 24 pesticides

2.4 回收率与精密度

选取不含目标分析物的地表水样品进行精密度和加标回收率的试验。24种标准品的加标水平为5、20、100 μg/L，每组平行实验3次(n=3)，计算加标回收率，结果如表3所示。24种农药的加标回收率为65.9%～127.8%，RSD为0.7%～14.2%，表明该方法的精密度和回收率符合残留分析要求。

表3 水样中24种农药的加标回收率和相对标准偏差(n=3)Table 3 Spiking recoveries and relative standard deviations of the 24 pesticides in water samples(n=3)

2.5 实际样品的分析

采用所建立的方法对大连地区10个河流入海口及2个水库水样中的农药进行了分析，共检出10种农药，农药残留情况如表4所示。由表可知，水体中检出的10种农药的残留量为0.2～558.3 ng/L，氯磺隆、除草定、乙草胺的检出率低，检出浓度相对较低；氯噻啉、扑草净、异丙甲草胺的检出率高，并且检出浓度也较高。其中，S4(黄石礁)水样中扑草净的浓度最大，为558.3 ng/L。

表4 12个地点水样中农药的分析结果Table 4 Analytical results of pesticides in water samples of 12 sites

-:not detected

3 结 论

本研究建立了固相萃取/高效液相色谱-串联质谱(SPE/HPLC-MS/MS)同时检测水体中常见24种农药的检测方法，该方法高效快速、准确可靠，检出限低，可满足多种农药残留的分析要求，具有很大的应用前景。

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Simultaneous Determination of 24 Pesticide Residues in Environmental Water Using Solid-phase Extraction and High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

HE Xin*,MA Yang-fan,ZHAO Hong-xia,NIE Xiao-jing

(Key Laboratory of Industrial Ecology and Environmental Engineering of Ministry of Education,College of Environment,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China)

A method of solid-phase extraction(SPE) and high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(SPE/HPLC-MS/MS) was developed for the simultaneous determination of 24 pesticides in water.The samples were extracted with acetonitrile,then enriched and purified with solid-phase extraction cartridges.Acetonitrile and 0.1%(by volume) formic acid aqueous solution were used as mobile phases.Target pesticides were analyzed by HPLC-MS/MS in positive electrospray ionization(ESI+) under multiple reaction monitoring(MRM) mode.Results showed that 24 pesticides were separated in 25 min with excellent linear relationships(r2≥0.998).The recoveries at spiked levels of 5,20,100 μg/L in water samples ranged from 65.9%-127.8% with relative standard deviations(RSDs) of 0.7%-14.2%.The limits of detection were in the range of 0.05-0.71 ng/L.This method was applied in the detection of the water samples from 10 estuaries and 2 reservoirs in Dalian，and 10 pesticides were detected in the concentration range of 0.2-558.3 ng/L.The proposed SPE/HPLC-MS/MS method is efficient and sensitive,and is suitable for the determination of various pesticides in actual water samples.

solid-phase extraction(SPE);high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS);pesticides;water detection

2017-07-19；

2017-08-30

中央高校基本科研业务费(DUT15LAB04)

*

何 欣，博士，工程师，研究方向：环境分析化学，E-mail:hexin@dlut.edu.cn

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.12.012

O657.63；O657.7

A

1004-4957(2017)12-1487-07