蔡程山, 张 英, 张雨森, 赵国柱

(北京林业大学生物科学与技术学院,北京 100083)

福建武夷山的野生干巴菌ThelephoraganbajunZang新分布

蔡程山, 张 英, 张雨森, 赵国柱

(北京林业大学生物科学与技术学院,北京 100083)

对福建武夷山疑似野生干巴菌的子实体，标本编号GB-WYS，进行形态和分子鉴定.ITS-5.8S rDNA扩增测序，获得656 bp核酸片段，与GenBank中产自云南的干巴菌同源比对分析，同源性达91%～94%.系统发育分析显示：GB-WYS与云南干巴菌以及干巴菌模式标本同属于一大的分支，又产生一定分化.结合形态特征、分子鉴定及生境特点将GB-WYS鉴定为干巴菌，并推断由于地理隔离，GB-WYS与云南的干巴菌存在一定的遗传分化.这是我国云南省之外罕见报道的野生干巴菌的新分布，扩大了干巴菌的生境范围，为其生态研究、保护开发等提供参考.

菌根真菌; 分类; 生态; 革菌

干巴菌ThelephoraganbajunZang为担子菌门革菌目革菌科革菌属[1]，又称松毛菌、绣球菌、对花菌、马牙菌.子实体莲花片状，纤维革质，高5～14 cm， 阔4～14 cm，灰色或灰棕色，幼时柔软，老后干韧.干巴菌是野生食用菌中的上品，菌香浓郁、生尝微甘，似有海藻气味，肉质坚韧，有腌牛肉干的浓郁香味，民间俗称“干巴”，因而得名干巴菌.干巴菌营养丰富，含有钙、铁、蛋白质、硫胺素等多种微量元素，具有抗氧化物质，能清除人体内的自由基，延缓衰老，强身健体等功效[2].它含有核苷酸、多糖等物质，有助于降低胆固醇，调节血脂，提高免疫力等[3-5]，而且对HIV逆转录酶有抑制作用[6]，抑制肿瘤细胞增殖等[7].

现有文献中干巴菌大多记载为我国云南省特有的野生食用菌[8]，以滇中高原为主，主产地为昆明、玉溪、曲靖、楚雄等[9]，多分布于600～2 500 m海拔的松林地带.每年七月到九月生长在马尾松、思茅松、云南松等林地上，并形成外生菌根[10].由于独特的地理生境、较高的经济食用价值和难以人工栽培等特点，自然资源极其有限.已有的研究多集中在云南省的干巴菌，包括分类、 菌种分离、营养成分测定等，云南之外，鲜有报道.

武夷山位于福建省西北部，东经117°37′22″—118°19′44″，北纬27°27′31″—28°04′49″，属中亚热带地区，四季气温较均匀、温和湿润，年平均气温12～13 ℃，降水量在2 000 mm以上，平均相对湿度高达85%，是福建省降水量最多的地区.武夷山国家自然保护区保存了世界同纬度带最完整、最典型、面积最大的中亚热带原生性森林生态系统，该保护区动植物菌类繁多，生物多样性丰富.笔者于2015年7月，在武夷山的大型菌物考察中，采集到一份疑似野生干巴菌标本，因该菌大多报道分布于我国云南，生境比较特殊，遂对其展开进一步的形态与分子研究，以明确我国云南之外(武夷山)是否分布野生干巴菌，为干巴菌的生境生态研究、保护应用开发等提供参考.

1 材料与方法

1.1 研究标本

2015年7月在福建武夷山黄岗山大峡谷松树阔叶树混交林地采集标本，编号GB-WYS；2016年8月在云南南华县食用菌交易市场购得云南新鲜干巴菌，编号GB-YNNH.

1.2 样品鉴定

1.2.1 形态学鉴定 对采集的标本进行形态学鉴定，包括子实体宏观特征，如大小、颜色、质地、菌片厚度等.在KOH，棉蓝，Melzer试剂中进行显色反应.微观特征包括：体视镜观察、显微镜观察、扫描电镜观察.体视镜下观察时，清除样本表面根部泥土，昆虫粪便等杂质，观察解剖特征等.显微镜观察，用无菌的镊子和剪刀剪取洁净的支片，制切片，于显微镜下观察菌丝组织结构，孢子形态特征.扫描电镜观察，用无菌的剪刀和镊子剪取0.5 cm×0.5 cm大小的干燥洁净组织块，用导电的双面胶粘贴在金属板上，放在小型离子溅射仪中镀金后，于扫描电镜下观察，拍照.

1.2.2 分子鉴定 DNA提取：取子实体干标本样品0.1 g，于灭菌好的研钵中研磨至粉末，采用上海浩然生物技术有限公司生产的真菌DNA小量提取试剂盒，按说明书步骤进行.ITS-5.8S rDNA区域的特异性PCR扩增：上游引物为ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，下游引物为 ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[11].PCR反应体系(50 μL)：Mix 25 μL，引物 ITS4、ITS5(20 μmol·L-1)各1 μL，DNA模板2 μL，加双蒸水(ddH2O)至50 μL.PCR反应条件：94 ℃预变性10 min，94 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环，最后72 ℃延伸7 min.PCR产物检测：取5 μL产物加1 μL 6×上样缓冲液于含Goldview的1.5%琼脂糖凝胶中电泳检测，PCR产物由北京睿博兴科测序生物公司纯化并测序.

基于rDNA ITS 序列构建系统发育树：使用多重序列比对分析软件BioEDIT对所得 ITS序列与GenBank中已公布的同属多株代表菌株以及干巴菌模式标本序列(云南大学王鹏飞博士论文中获取的干巴菌模式标本ITS序列)[12]进行比对(Alignment).应用 MEGA 6.0软件进行分析，采用邻近连接法(Neighbor-Joining Method)进行聚类分析，选取Thelephoraregularis(U83485.1)做系统发育树的外群，以自展法(bootstrap)进行显著性分析检验，重复1000次[13].

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

GB-WYS：子实体子层高3～12 cm，直径5～13 cm，珊瑚状多次分支，基部肉质较厚，沿子实体菌片向上依次裂成扇形或扫梳状小分支，顶端的小枝片高5 cm，多次分支，小支片边缘锯齿状.子实体整体灰褐色，有浓郁的菌香(图1A).在普通光学显微镜下(400倍)可以看到大量的担孢子，孢子边缘不整齐，有疣突(图1C)，菌丝体扭结清晰可见.孢子和菌丝体在棉兰试剂中有明显的嗜蓝反应，KOH反应呈蓝色； Melzer试剂反应呈蓝黑色.扫描电镜观察，可以清晰看到孢子，担孢子(7～12)μm×(6～8) μm，通常圆球型，淡褐色，有时失水多有变形，褶皱，多角形，有疣突(图1B、D).菌丝粗4～6 μm，具锁状联合，透明，尖端扭曲.

2.2 分子鉴定

对武夷山采集到的疑似干巴菌子实体标本GB-WYS和云南的干巴菌GB-YNNH，分别提取DNA后，PCR扩增ITS-5.8S rDNA基因区段，产物电泳可见650 bp左右的清晰电泳条带(图2).两份标本均成功扩增了ITS-5.8S rDNA区段.

干巴菌GB-WYS测序结果显示，ITS区(包含5.8S rDNA)全长656 bp(KU847425)，GC含量51.37%.将GB-WYS、GB-YNNH、干巴菌模式标本(云南大学王鹏飞博士论文中获取的干巴菌模式标本ITS序列，未在GenBank中到)[12]以及GenBank中Gb001、Gb077和Gb259等基因序列[14]输入到ClustalW软件中分析，发现GB-WYS样本扩增序列含有缺失位点3个，插入位点2个，碱基突变位点33个.

A:子实体；B,D:扫描电镜下的干巴菌担孢子，表面具有明显的疣突；C：普通光学显微镜下的担孢子.图1 福建武夷山的干巴菌(GB-WYS)形态学分析Fig.1 T.ganbajun Zang (GB-WYS) collected from Wuyi Mountain, Fujian

1.Marker;2.武夷山的干巴菌GB-WYS;3.云南的干巴菌 GB-YNNH;4.阴性对照.图2 干巴菌的ITS-5.8S rDNA片段PCR产物电泳结果Fig.2 PCR electrophoresis of ITS-5.8S rDNA of T.ganbajun Zang

从GenBank筛选革菌属Thelephora，毛革菌属Tomentella，两属5个干巴菌相似种(Tomentellasublilacina、Tomentellasubtestacea、Thelephoraversatilis、Thelephoracaryophyllea、Thelephoraterrestris)共10份标本的ITS-5.8S rDNA序列(每种2个标本/菌株序列)，与模式标本T.ganbajunfruit type[12]，GB-WYS、GB-YNNH以及GenBank中干巴菌Gb001、Gb077和Gb259标本的ITS-5.8S rDNA序列构建系统发育树(图3).可以明确看出武夷山的干巴菌GB-WYS和干巴菌模式标本[12]，GB-YNNH以及Gb001、Gb077和Gb259菌株分布在同一大分支上，支持率(Bootstrap值)高于96%，而与革菌科下的其它属种距离较远.结合形态特征，确定武夷山的标本GB-WYS为干巴菌T.ganbajunZang.但是在系统发育树上，武夷山的干巴菌GB-WYS与云南的干巴菌存在一定的分化，分析可能是地理隔离造成的.

T.regularis为外群.图3 基于rDNA-ITS序列构建的干巴菌GB-WYS的N-J系统发育树Fig.3 N-J phylogenetic tree of rDNA-ITS of T.ganbajun Zang GB-WYS

3 讨论

干巴菌在我国云南采食历史悠久，但分类学地位一直存在争议，长期被认为是绣球菌Sparassiscrispa(Wulf.) Fr.，直到臧穆系统研究和比较之后，认为干巴菌并非绣球菌，并建立一新种T.ganbajunZang，才得以澄清[15].民间人们平常所习称的干巴菌除了干巴菌(T.ganbajunZang)，也常包含莲座革菌(T.vialisSchwein)和橙黄革菌(T.aurantiotinctaCorner)[4].在诸多文献报道中，干巴菌常作为我国云南特有的种类，然而近年对福建莆田老鹰尖自然保护区、安徽鹞落坪自然保护区、江西省、四川省等地的大型真菌考察，偶有报道野生干巴菌的存在，但未见详细的形态描述和分子鉴定[16-19].林汝楷等曾对武夷山进行系统的大型真菌资源考察，采集大型真菌标本827份，共鉴定232种，食用菌102种，均未见干巴菌的报道[20].笔者在福建武夷山的考察发现疑似野生干巴菌，子实体宏观与显微形态特征与云南报道的较为吻合，然而分子鉴定结果存在一定差异.

通过对标本ITS-rDNA序列对比分析，发现武夷山的干巴菌GB-WYS比云南的干巴菌类群多个基因突变位点.在系统发育树上，虽然聚在一个大的分支上，但也表现出一定的遗传分化，这与王鹏飞对云南干巴菌群体的遗传学研究相吻合.他发现各基因的等位基因在云南滇中地区分布较多，少数具有明显独立遗传特性的群体分布于滇中之外的边缘地区中，说明基因流交汇区域为滇中，边缘地区因基因流较少而保留了少量的遗传分化特性[12].Sha et al[14]表示干巴菌的基因流动是有限的，云南同一地区内的遗传分化通常在7%以内，地区之间的遗传分化低于小于10%，说明云南省内不同地域的干巴菌也存在较大的遗传分化.福建武夷山与云南相距约2 000 km，因此判断云南干巴菌与福建武夷山干巴菌为两个独立的种群.对于存在地理隔离的不同群体来说，GB-WYS与云南的干巴菌类群同源性在91%～94%之间，群体之间可能因为缺乏基因交流而出现的遗传分化，属于种内变异，但也不能否认远距离的异域分化形成不同物种的可能.标本GB-WYS的外貌形态、气味(浓郁菌香)、孢子形态、生境等特点，均与云南干巴菌较为吻合[10,15]，结合分子序列将其鉴定为干巴菌.由于获得的武夷山干巴菌标本数量有限，不排除将来获得大量标本材料进一步深入研究定为新种的可能.这是我国云南之外较为系统深入的干巴菌的研究报道，不但丰富了福建武夷山大型野生食用菌的种类，扩大了干巴菌的生境范围和地理分布，而且为干巴菌及其相关类群真菌的研究提供了重要信息.

干巴菌是一种外生菌根真菌，与伴生植物关系密切，另受气候、海拔、降雨量等环境因素影响.它的自然资源稀缺，虽然可以通过宜林地的管理、合理采集和人工促繁等方法来维持和增加自然产量[21]，但尚未实现完全人工栽培.干巴菌市场的供应主要来自云南，完全依赖采集野生资源，简单索取、无序利用，野生干巴菌的自然资源和生态环境已受到严重破坏，价格逐年攀升[22]，产量和质量逐年下降[23].如何合理的保护开发和利用，探索云南之外干巴菌适宜的栖息繁殖保护地，应引起人们的重视.本次云南之外的野生干巴菌报道，对其生态习性、基因的多样性、遗传发育进化，保护开发等具有重要参考.

[1] 李玉,李泰辉,杨祝良,等.中国大型菌物资源图鉴[M].郑州:中原农民出版社,2015:1 349.

[2] LIU J K, HU L, DONG Z J, et al. DPPH radical scavenging activity of ten natural p-terphenyl derivatives obtained from three edible mushrooms indigenous to China[J]. Chemistry & Biodiversity, 2004,1:601-605.

[3] 陈亚萍,邱幵雄,陈亚娟,等.干巴菌抗氧化活性研究[J].昆明医学院学报,2012,33(1):40-42.

[4] 傅四清,魏蓉城.干巴菌研究进展[J].林业科技通讯,1997(8):21-23.

[5] ZHAO Y Y, HOU B, TANG Z J, et al. Application of ultrasonics to enhance the efficiency of cleaningThelephoraganbajun[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2009,16:209-211.

[6] WANG H X, NG T B. Purification of a novel ribonuclease from dried fruiting bodies of the edible wild mushroomThelephoraganbajun[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004,324:855-859.

[7] XU D P, ZHENG J, ZHOU Y, et al. Extraction of natural antioxidants from theThelephoraganbajunmushroom by anultrasound-assisted extraction technique and evaluation of antiproliferative activity of the extract against human cancer cells[J]. Molecular Sciences, 2016,17:1 664-1 679.

[8] ZHANG P, LUO X Y, WU Y, et al. Optimization of submerged fermentation ofThelephoraganbajunZang[J]. Journal of Basic Microbiology, 2014,54:866-872.

[9] 郭安,胡慧蓉,赵凤喜,等.云南优特野生食用菌——干巴菌的开发利用[J].西南林学院学报,1998,18(2):105-108.

[10] 臧穆.东喜马拉雅引人注目的高等真菌和新种[J].云南植物研究,1987,9(1):81-88.

[11] WHITE T J, BRUNS T, LEE S. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA gene for phylogenetics[M]∥INNIS M A, GELFAND D H, SNINSKY J J, et al. PCR protocols: a guide to methods and application. San Diego: Academic Press, 1990:315-322.

[12] 王鹏飞.Thelephora-Tomentella分子系统发育及干巴菌群体遗传学和线粒体异质性研究[D].昆明：云南大学,2015.

[13] TAMURA K, STECHER G, PETERSON D, et al. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J]. Molecular Biology and Evolution, 2013,30(12):2 725-2 729.

[14] SHA T, XU J P, PALANICHAMY M G, et al. Genetic diversity of the endemic gourmet mushroomThelephoraganbajunfrom south-western China[J]. Microbiology, 2008,154:3 460-3 468.

[15] 臧穆.“干巴菌”考[J].食用菌,1986(4):1-2.

[16] 李碧琼,陈政明,卢翠香,等.莆田老鹰尖自然保护区野生食用菌资源调查[J].中国食用菌,2012,31(1):8-10.

[17] HE Y X, WU W B, LI N S. A checklist of macrofungi in yaoluoping nature reserve, Anhui[J]. Journal of Resources and Ecology, 2016,7(2):144-150.

[18] 张俊波,宋海燕,胡殿明.江西大型真菌名录调查初报[J].生物灾害科学,2016,39(1):113.

[19] 谭方河,王云璋.四川松树、桉树外生菌根菌种类调查[J].四川林业科技,2000,21(3):65-69.

[20] 林汝楷,郑群力,江宝兴,等.福建省武夷山风景名胜区大型真菌资源考察初报[J].食用菌学报,2010,17(1):86-94.

[21] 桂明英,刘落,朱萍,等.干巴菌生态学初步研究[J].西南农业学报,2005,18(3):325-327.

[22] HE J, ZHOU Z M, YANG H X, et al. Integrative management of commercialized wild mushroom: A case study ofThelephoraganbajunin Yunnan, Southwest China[J]. Environmental Management, 2011,48:98-108.

[23] 周志美,杨会贤,尚素.野生干巴菌人工促繁与保育技术措施研究[J].中国食用菌,2010,29(2):17-18.

AnewdistributionofThelephoraganbajunZanginWuyiMountain,Fujian,China

CAI Chengshan, ZHANG Ying, ZHANG Yusen, ZHAO Guozhu

(College of Biological Sciences and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China)

A suspected wildThelephoraganbajunspecimen (No.GB-WYS) was found in Wuyi Mountain, Fujian Province. A 656 bp ITS-5.8S rDNA sequence fragment was obtained from the fruiting body of GB-WYS, which shared 91%-94% similarity withT.ganbajunsequence from Yunnan. In the phylogenetic tree, GB-WYS clustered with those from Yunnan and type specimen, but with a short distance. Combined morphological characteristics, molecular identification and habitat characteristic of GB-WYS, it was identified asT.ganbajun. Meanwhile, we inferred that the geographical segregation resulted in a certain genetic differentiation between GB-WYS andT.ganbajunin Yunnan. This is a new distribution of wildT.ganbajunoutside Yunnan Province, which expanded the habitat range ofT.ganbajunand provided important reference for its ecological research, protection and development.

mycorrhizal fungi; taxonomy; ecology;Thelephora

2017-05-31

2017-08-13

国家自然科学基金资助项目(31570019, J1310005).

蔡程山(1990-)，男，硕士研究生.研究方向：食药用真菌资源开发.Email:2862536108@qq.com.通讯作者赵国柱(1976-),男，博士，硕士生导师.研究方向：真菌分类和食药用菌资源开发.Email:zhaogz@im.ac.cn.

Q939.5

A

1671-5470(2017)06-0692-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.06.015

(责任编辑:苏靖涵)