柳浦青++何冰冰++陈锋

[摘要] 阿尔茨海默病是中枢神经系统退行性病变之一，其病理机制主要是各种原因导致的神经元Aβ沉积，包括ATP和谷氨酸不足引起的Aβ沉积。应用光基因技术可以选择性激活表达光敏感通道蛋白的星形胶质细胞，并促其释放ATP和谷氨酸，从而阻断由于ATP和谷氨酸不足引起的Aβ沉积。因此光基因技术有望应用于阿尔茨海默病的治疗，并且避免药物治疗在非选择性及广泛不良反应方面的缺点。

[关键词] 阿尔茨海默病；光基因技术；光敏感通道；三磷酸腺苷；谷氨酸

[中图分类号] R338 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）11（a）-0040-04

The research progress in mechanism of optogenetics activated astrocytes release ATP and glutamate to protect neurons in Alzheimer′s disease

LIU Puqing HE Bingbing CHEN Feng

Department of Pharmacy， the Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medicine University Xinhua Hospital of Zhejiang Province， Hangzhou 310005， China

[Abstract] Alzheimer disease′s （AD） is one kind of degenereratly neuropathic disease. The pathomechanism of AD is the deposite of Aβ peptide， including ATP and glutamate insufficiency resulted Aβ deposite. Application of phogenetic technology can selectively activate astrocytes transfected with ChR2， promote the release ATP and glutamate， block the Aβ aggregation producing by insufficient of ATP and glutamate. Conclusion as a result， ChR2 mediated optogenetic technology can be used for AD treatment. This new treropeutical method will avoid the defects of non-selective and extensive side-effects.

[Key words] Alzheimer′s disease； Optogenetic technology； ChR2； ATP； Glutamate

阿尔茨海默病是以一种进行性发展的神经系统退行性疾病，尤其在65岁以上老人中多见。随着全球老年化趋势加重，阿尔茨海默病问题逐渐凸显，对于该病的预防和治疗也越来越受到重视。目前临床上对于阿尔茨海默病的治疗水平停留在药物控制疾病进展水平，然而药物的副作用多且广泛，并非理想的治疗方式。

光基因技术是将光敏感通道作为一种生物工具，可选择性作用于特定细胞，引起相应的生理学功能。目前研究表明运用光基因技术可以选择性激活星形胶质细胞，而星形胶质细胞的活动直接对神经元产生调控作用。如果通过光基因技术调控星形胶质细胞从而延缓神经元退行性病变，可弥补药物治疗存在的不足，为阿尔茨海默病患者提供新的希望。

1 ATP和谷氨酸对阿尔茨海默病神经元退行性病变的保护作用

阿尔茨海默病是一种神经退行性疾病，其病因和发病机制目前尚未完全明了。目前认为AD的病理改变主要表现为老年斑和神经元纤维缠结的形成，前者与β-淀粉样蛋白（Aβ）的沉积有关。Aβ由淀粉样蛋白前体物质APP分解而得，其中42/43肽的Aβ则是老年性斑块中细胞外淀粉样蛋白的主要成分，并且这种老年性斑块和神经活动有关。APP在体内有两种代谢途径：若先经β分泌酶作用，产生sAPPβ和C99，C99再经γ分泌酶作用产生Aβ和AICD；若先经α分泌酶作用，产生sAPPα和C83，C83再经γ分泌酶作用产生p3和AICD。β分泌酶途径产生的Aβ沉积损伤神经元细胞，而α分泌酶途径产生的sAPPα对神经元产生神经营养和保护作用[1-2]。国内外研究表明，ATPα合成酶可以抑制Aβ介导的神经毒性损伤，并且抑制Aβ的聚集；而拮抗ATP合成的自身抗体则诱导神经元凋亡并损害小鼠的认知功能[3]。最近有研究发现，ATP等能量物质可有效增加APP的α分泌酶途径，减少双氧水、鱼藤酮引起的能量缺失和氧化应激损伤，从而减慢阿尔茨海默病的疾病进展[4]。谷氨酸是中枢神经系统（CNS） 最主要的兴奋性神经递质，对正常脑功能和CNS疾病发挥重要的调节作用。研究表明谷氨酸作用于代谢型谷氨酸受体mGluR5促进sAPPα释放，减少Aβ的沉积[5]。APP的加工理论认为，Aβ的产生与sAPPα的产生存在一种此消彼长的关系。sAPPα也具有保护谷氨酸和葡萄糖转运体免受氧化应激损伤的功能，谷氨酸可以减少APP诱导的神经元树突棘结构大量丢失，进一步补充突触对谷氨酸摄取能力的不足[6]。

2 星形胶质细胞的活动及其分泌ATP、谷氨酸等神经递质的意义

星形膠质细胞是CNS中主要的神经细胞，占大脑细胞数的90%。传统研究认为其主要功能是对神经元其营养、支持和保护作用，但随着研究的深入发现其还具有调控神经元信息传递功能[7-8]。星形胶质细胞对神经元的各种调控作用与其本身的活动息息相关，钙波是星形胶质细胞活动的一种表现形式[9]。星形胶质细胞钙波产生机制较复杂，有自发产生也有接受外界刺激后产生。钙波起始时间，幅度及持续时间形式不规则也较难预测，表现形式为胞浆内钙离子浓度或一过性升高或起伏变化或持续升高等。钙波还可在细胞与细胞之间进行传递[10]。星形胶质细胞作为神经元辅助细胞，其包膜表面表达各种神经递质受体和神经调质受体。当神经元突触功能失调时，胞外的神经递质和调质失衡。星形胶质细胞可被失衡的胞外环境激活，产生钙波振荡，释放各种神经递质并发挥相应的调控作用[11]。研究表明，激活的星形胶质细胞可以释放多种神经递质，例如ATP、谷氨酸、D-丝氨酸等[12-13]。这些递质可与神经元上的神经递质受体结合，对神经元产生各种调控作用。神经元上存在嘌呤受体，胞外核苷酸受体称为P2受体，包括P2X和P2Y两类。其中P2X受体是配体ATP门控的离子通道，P2X通道与胞外ATP结合时打开，让特定的阳离子通过，激活下游信号，产生一系列生物效应[14-15]。ATP亦可通过神经元P2X通道进入细胞内，补充线粒体破裂引发的能量不足，减少氧化应激损伤[16]。谷氨酸是胶质细胞释放的另一主要递质，星形胶质细胞根据胞外环境释放或者摄取谷氨酸，使其维持在相对稳定的水平[17-19]。释放到胞外的谷氨酸作用于临近的神经元谷氨酸受体包括谢型谷氨酸受体mGluR5、AMPA受体、NMDA受体、Kainate受体而引起神经元树突棘形态和运动变化已多见报道[20-21]。谷氨酸作用于代谢型谷氨酸受体mGluR5促进sAPPα释放，减少Aβ的沉积[5]。AMPA受体与Aβ诱导的突触抑制和树突棘丢失密切相关，通过稳定AMPA受体可能延缓阿尔茨海默病的发展[22]。endprint

3 光基因调控—Channelrhodopsin2选择性激活星形胶质细胞的技术

光基因技术是目前国内外研究的热点，对于研究神经回路研究有其独特的优越性。既可避免电刺激的不精确性和侵入性，又可避免药物作用非特异性[23]。其中光敏感通道Channelrhodopsin2是光基因技术中核心的技术工具之一。

3.1 基于光敏感通道Channelrhodopsin2的光基因技术

1991年研究者发现莱茵衣藻有趋光和避光反应，这种现象是由一种微生物来源的叫做视紫红质的物质调节的。经过研究发现莱茵衣藻基因里有两种视紫红质的cDNA，Chop1和Chop2。Chop1和Chop2的本质是与微生物来源的视蛋白具有同源性的脱辅基蛋白，与视黄醛共价结合后分别形成Channelrhodopsin-1（ChR1）和Channelrhodopsin-2（ChR2）。ChR2是一个七次跨膜的非选择性阳离子通道蛋白，在强光照射下通道打开，细胞外的阳离子进入细胞内形成离子流，该离子流即为光电流。ChR2在460 nm处有最大吸收波长，且对光照的反应极为迅速，强光照射下ChR2可以在几个微秒内形成光电流。ChR2虽然是非选择性阳离子通道，但是对不同的阳离子的通透性并不相同。根据离子半径大小不同，ChR2对阳离子的通透性排列如下：Ca2+>Sr2+>Ba2+>Zn2+>Mg2+（≈0）。

ChR2主要有两种结构，一种是737个氨基酸组成的全长蛋白ChR2-737，另一种是315个氨基酸组成的C端经过剪切的修饰蛋白ChR2-315，因为第316～715个氨基酸序列对于ChR2的光电流没有任何影响。ChR2-315的cDNA能够在动物细胞HEK-293和BHk内表达，并且在光照的诱导下可以产生相当大的光电流，这个电流足以使卵母细胞和HEK-293发生去极化。ChR2结构上通常带有一个小分子的荧光蛋白，用来标记ChR2在细胞上的表达情况[24-26]。离子通道蛋白可对化学分子和电信号做出反应，而光敏感通道 Channelrhodopsin2能被特定波长（480 nm）的光线控制，而且该离子通道蛋白的反应程度取决于光刺激的强度和持续时间。因而可通过调节光刺激程序，调控该通道的开放程度，常规的物理或化学刺激手段很难解决这一问题[27]。

3.2 光敏感通道Channelrhodopsin2在星形膠质细胞上的表达应用

星形胶质细胞对发生退行性病变神经元的保护作用主要通过其活动产生的神经递质ATP和谷氨酸实现。如何实现星形胶质细胞对神经元直接的调控作用，需要解决两个技术问题：其一，选择性激活混合培养的星形胶质细胞。细胞内钙升高是星形胶质细胞活动的一个主要形式，是星形胶质细胞释放信号分子的先决条件[28]。ChR2对Ca2+的通透性最大，对星形胶质细胞的活动意义重大。ChR2作为光基因调控技术手段的工具之一已经广泛应用于神经系统研究。国内外研究发现通过选择性光调控神经元放电和信息传递，已经达到改变动物认知奖赏行为、呼吸、睡眠觉醒等行为目的[29-32]。在星形胶质细胞转染光敏感通道Channelrhodopsin2发现ChR2可以在星形胶质细胞表面稳定表达。用波长480 nm的蓝光刺激胶质细胞，有效地激发了胶质细胞钙波，并观察不同刺激程序对星形胶质细胞钙波形式的影响。其二，建立星形胶质细胞和神经元细胞混合培养的AD细胞模型，选择性激活模型中的星形胶质细胞。在前期研究中实验室所建立星形胶质细胞和神经元细胞混合培养模型为正常生理条件模型。为建立AD细胞模型，采用转基因AD小鼠（Tg2576）。Tg2576小鼠在APP基因的表达、淀粉样斑块的形成、神经元的退变和记忆丢失等方面表现出许多与AD患者的相似性。Tg2576小鼠为AD的研究提供了理想的动物模型，其原代培养的神经元细胞用于神经元退行性病变的机制研究[33-35]。

4 展望

星形胶质细胞对神经元具有营养、支持、保护作用，其功能主要通过激发钙波后释放 ATP、谷氨酸、D-丝氨酸等神经递质实现。星形胶质细胞对阿尔茨海默病神经元的保护作用虽早有报道，但是否通过激发星形胶质钙波从而对神经元Aβ生成产生抑制尚不明确。过去科学家一直在寻找利用化学物质直接促进神经元交流，本研究运用光基因技术、荧光成像技术及分子生化技术，围绕星形胶质细胞兴奋能否保护退行性病变的神经元细胞展开，建立阿尔茨海默病细胞模型，探索其保护机制是否通过ATP/谷氨酸-sAPPα-Aβ分子信号通路实现。旨在探明星形胶质细胞活动对AD神经元的保护机制，为进一步开展阿尔茨海默病小鼠行为学实验奠定基础，为AD治疗研究提供新方法和新思路。

[参考文献]

[1] Baek SH，Park SJ，Jeong JI，et al. Inhibition of Drp1 Ameliorates Synaptic Depression，Aβ Deposition，and Cognitive Impairment in an Alzheimer's Disease Model [J]. Neurosci J，2017，37（20）：5099-5110.

[2] Kiprowska MJ，Stepanova A，Todaro DR，et al. Neurotoxic mechanisms by which the USP14 inhibitor IU1 depletes ubiquitinated proteins and Tau in rat cerebral cortical neurons：Relevance to Alzheimer's disease [J]. Biochim Biophys Acta，2017，1863（6）：1157-1170.

[3] Gallart-Palau X，Lee BS，Adav SS，et al. Gender differences in white matter pathology and mitochondrial dysfunction in Alzheimer′s disease with cerebrovascular disease [J]. Mol Brain，2016，17（9）：27.endprint

[4] Sawmiller DR，Nguyen HT，Markov O，et al. High-energy compounds promote physiological processing of Alzhermer′s amyloid-β precursor protein and boost cell survival in culture [J]. Neurochem J，2012，123（4）：525-531.

[5] Ahuja M，Buabeid M，Abdel-Rahman E，et al. Immunological alteration & toxic molecular inductions leading to cognitive impairment & neurotoxicity in transgenic mouse model of Alzheimer's disease [J]. Life Sci，2017，177：49-59.

[6] Monjas L，Arce MP，León R，et al. Enzymatic and solid-phase synthesis of new donepezil-based L- and d-glutamic acid derivatives and their pharmacological evaluation in models related to Alzheimer's disease and cerebral ischemia [J]. Eur J Med Chem，2017，130：60-72.

[7] Diniz LP，Tortelli V，Matias I，et al. Astrocyte transforming growth factor beta 1 protects synapses against Aβ oligomers in Alzheimer′s disease model [J]. Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience，2017， 37（28）：6797-6809.

[8] Baldwin KT，Eroglu C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis [J]. Curr Opin Neurobiol，2017， 45：113-120.

[9] Wu XM，Qian C，Zhou YF，et al. Bi-directionally protective communication between neurons and astrocytes under ischemia [J]. Redox Biol，2017，13：20-31.

[10] Losi G，Mariotti L，Sessolo M，et al. New Tools to Study Astrocyte Ca2+ Signal Dynamics in Brain Networks In Vivo [J]. Front Cell Neurosci，2017，11：134.

[11] Makitani K，Nakagawa S，Izumi Y，et al.Inhibitory effect of donepezil on bradykinin-induced increase in the intracellular calcium concentration in cultured cortical astrocytes [J]. Pharmacol Sci J，2017，134（1）：37-44.

[12] Scemes E，Giaume C. Astrocyte calcium waves：what they are and what they do [J]. Glia，2006，54（7）：716-725.

[13] Schipke CG，Kettenmann H. Astrocyte responses to neuronal activity [J]. Glia，2004，47（3）：226-232.

[14] Wilkaniec A，Schmitt K，Grimm A，et al. Alzheimer's amyloid-β peptide disturbs P2X7 receptor-mediated circadian oscillations of intracellular calcium [J]. Folia Neuropathol，2016，54（4）：360-368.

[15] Qin J，Zhang X，Wang Z，et al. Presenilin 2 deficiency facilitates Aβ-induced neuroinflammation and injury by upregulating P2X7 expression [J]. Sci China Life Sci，2017， 60（2）：189-201.

[16] Correia SC，Santos RX，Santos MS，et al. Mitochondrial abnormalities in a streptozotocin-induced rat model of sporadic Alzheimer′s disease [J]. Curr Alzheimer Res，2013， 10（4）：406-419.

[17] Scimemi A，Diamond JS. Deriving the time course of glutamate clearance with a deconvolution analysis of astrocytic transporter currents [J]. Journal of Visualized Experiments Jove，2013，7（78）：e50708.endprint

[18] Dienel GA. Astrocytic energetics during excitatory neurotransmission：What are contributions of glutamateoxidation and glycolysis？[J].Neurochem Int，2013，63（4）：244-258.

[19] Jacobs VL，De Leo JA. Increased glutamate uptake in astrocytes via propentofylline results in increased tumor cell apoptosis using the CNS-1 glioma model [J]. Neurooncol J，2013，114（1）：33-42.

[20] Kim SK，Nabekura J，Koizumi S. Astrocyte-mediated synapse remodeling in the pathological brain [J]. Glia，2017，65（11）：1719-1727.

[21] Sando R，Bushong E，Zhu Y，et al. Assembly of Excitatory Synapses in the Absence of Glutamatergic Neurotransmission [J]. Neuron，2017，94（2）：312-321.

[22] Hsieh H，Boehm J，Sato C，et al. AMPAR removal underlies Abeta-induced synaptic depression and dendritic spine loss [J]. Neuron，2006，52 （5）：831-843.

[23] Welberg L. Techniques：Optogenetics takes more control [J]. Nat Rev Neurosci，2013，14（9）：587.

[24] Georg N，Tanjef S，Wolfram H，et al. Channelrhodopsin-2，a directly light-gated cation-selective membrane channel [J]. PNAS，2003，100（24）：13940-13945.

[25] Nagel G，Szellas T，Kateriya S，et al. Channelrhodopsins：directly light-gated cation channels [J]. Biochem Soc T，2005，33（4）：863-866.

[26] Li X，Davina V，Gutierre Z，et al. Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin [J]. PNAS，2005，102（49）：17816-17821.

[27] Zhang YP，Oertner TG. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. at Methods [J]. Nat Methods，2007，4（2）：139-141.

[28] Handy G，Taheri M，White JA，et al. Mathematical investigation of IP3-dependent calcium dynamics in astrocytes [J]. Comput Neurosci J，2017，42（3）：257-273.

[29] Adamantidis A，Arber S，Bains JS，et al. Optogenetics：10 years after ChR2 in neurons-views from the community [J]. Nat Neurosci，2015，18（9）：1202-1212.

[30] Warren A，Xiang Li，Kevin P， et al. Light Induced Rescue of Breathing After Spinal Cord Injury [J]. Neurosci J，2008，28（46）：11862-11870.

[31] Cerritelli S，Hirschberg S，Hill R，et al. Activation of Brainstem Pro-opiomelanocortin Neurons Produces Opioidergic Analgesia，Bradycardia and Bradypnoea [J]. PLoS One，2016，11（4）：e0153187.

[32] Antoine RA，Feng Z，Alexander MA，et al. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons [J]. Nature，2007，450：420-425.

[33] Snellman A，López-Picón FR，Rokka J，et al. Longitudinal Amyloid Imaging in Mouse Brain with 11C-PIB：Comparison of APP23，Tg2576，and APPswe-PS1dE9 Mouse Models of Alzheimer Disease [J]. Nucl Med J，2013，54（8）：1434-1441.

[34] Kishimoto Y，Higashihara E，Fukuta A，et al. Early impairment in a water-finding test in a longitudinal study of the Tg2576 mouse model of Alzheimer's disease [J]. Brain Res，2013，1491：117-126.

[35] Tiwari SS，Mizuno K，Ghosh A，et al. Alzheimer-related decrease in CYFIP2 links amyloid production to tau hyperphosphorylation and memory loss [J]. Brain，2016，139（10）：2751-2765.

（收稿日期：2017-06-01 本文編辑：程 铭）endprint