郭晓龙， 张青峰， 野庆松， 莫镇涛， 李文娜， 高书颖

(遵义医学院珠海校区 生物工程系， 珠海 519041)

靶向ezrin增强子关键区的CRISPR/Cas9载体的构建

郭晓龙， 张青峰， 野庆松， 莫镇涛， 李文娜， 高书颖

(遵义医学院珠海校区 生物工程系， 珠海 519041)

构建靶向人ezrin增强子关键区的CRISPR/Cas9载体并检测其基因敲除功能。设计2个gRNA，分别靶向人ezrin增强子关键区的上、下游。合成gRNA寡核苷酸序列，连接至质粒pX459构建重组质粒pX459-sgRNA-EL和pX459-sgRNA-ER。将鉴定正确的CRISPR/Cas9重组质粒共转染至食管癌EC109细胞中，提取细胞基因组DNA，针对gRNA靶位点两侧进行PCR扩增和亚克隆测序分析。经限制性内切酶酶切和测序鉴定表明，CRISPR/Cas9重组质粒构建正确。在共转染重组质粒的细胞基因组DNA中检测到ezrin增强子关键区的缺失。成功构建了靶向人ezrin增强子关键区的CRISPR/Cas9载体，能够实现目标序列的定向敲除。

靶向敲除；ezrin增强子；CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated)是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫[1]。CRISPR/Cas9系统借鉴细菌的防御策略，由gRNA(guide RNA)寻找特定的DNA序列，然后利用Cas9核酸内切酶对靶DNA进行切割，造成双链断裂，在没有模板的情况下，发生非同源末端连接，造成DNA缺失突变[2]。目前，CRISPR/Cas技术已广泛应用于多种细胞和模式生物的基因编辑[3-5]。

肿瘤相关基因ezrin在人食管癌[6]、胰腺癌[7]、前列腺癌[8]、乳腺癌[9]等多种肿瘤中存在异常表达现象，其表达上调与肿瘤细胞的移动侵袭相关。以往采用双荧光素酶报告基因检测系统研究发现，在人ezrin编码区的上游存在启动子和增强子区，ezrin增强子关键区-1297/-1186序列很可能对于Ezrin在肿瘤细胞中的高表达起重要作用[10-11]。……