高 山，梁 健，李永仁，马云昆，郭永军，闫喜武

( 1.天津农学院 水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384； 2.大连海洋大学，辽宁省贝类良种繁育工程技术研究中心，辽宁 大连 116023 )

海水酸化对青蛤耗氧率和排氨率的影响

高 山1，梁 健1，李永仁1，马云昆1，郭永军1，闫喜武2

( 1.天津农学院 水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384； 2.大连海洋大学，辽宁省贝类良种繁育工程技术研究中心，辽宁 大连 116023 )

在水温(29.5±0.5) ℃、盐度25条件下，用3个独立循环水槽系统同时充入空气和纯CO2气体，利用气体质量流量计控制CO2的流量使海水pH为7.7±0.05和7.4±0.05,以pH 8.3 的天然海水为对照，研究海水酸化对青蛤耗氧率、排氨率及O∶N的影响。试验结果表明，随着海水酸化的加强，青蛤累计死亡数上升，呈正相关性，死亡率依次为pH 7.4>pH 7.7>pH 8.3；耗氧率随pH的升高而降低，而较低的pH对青蛤排氨率有促进作用;O∶N值随pH的降低而降低，一定范围内的海水酸化会对青蛤的存活及代谢有影响，但这些影响对青蛤的生存和代谢并不致命，青蛤会随着海水酸化时间来调节自身代谢以适应海洋酸化，本结果为青蛤对海洋酸化适应提供了基础理论。

海洋酸化；青蛤；耗氧率；排氨率；O∶N

海洋是一个巨大的CO2收集库，在全球碳循环中起重要作用, 自工业革命以来，海洋已吸收了人类活动所排放CO2总量的1/3以上, 对缓解全球变暖起了重要作用[1]。目前海洋的pH较工业革命前降低了0.1个单位，预测到21世纪末期将持续降低0.3～0.5个单位，到2300年大气中增加的CO2含量将会引起pH降低0.7[2]。海洋酸化对海洋生态系统的平衡产生重大的影响，可能导致物种组成(珊瑚、贝类、棘皮动物、甲壳动物和鱼类等)发生变化。贝类作为主要的钙化生物，可加强海洋生态系统稳定性，防止海水富营养化。因此，近年来大多数研究以贝类作为主要对象探讨海洋酸化对生态系统的影响。

青蛤(Cyclinasinensis)是中国南北沿海滩涂常见的重要经济双壳贝类，但在海洋酸化下对青蛤呼吸代谢的研究较少。本文研究了海水不同pH值下青蛤的排氨率及耗氧率的变化，探讨海洋酸化条件下青蛤的呼吸代谢特征，为日益酸化中的海水养殖提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用青蛤采自独流碱河河口滩涂，规格均匀，湿质量为(11.362±0.7) g，室内暂养14 d后，在天津市海升水产养殖公司的贝类育苗车间进行试验，试验水温(29.5±0.5) ℃、盐度25。

1.2 方法

1.2.1 海水酸化控制系统

试验中，海水酸化控制系统主要由两部分组成(图1)：(1)气体系统，主要为气泵、CO2气瓶、气体质量流量控制器和积算仪；(2)3个独立的循环水养殖系统，由水泵、加热棒、生物滤盒和水槽组成。3个独立的循环系统运行时，循环水的pH保持在3个水平，对照组仅充入空气，海水的pH为8.3，其他两组同时充入空气和纯CO2气体，以pH计测定系统中海水的pH值，利用气体质量流量计控制CO2的流量维持pH为7.7±0.05和7.4±0.05。

1.2.2 试验过程

暂养结束后，将试验青蛤置于3个养殖箱内，每箱130枚。试验期间，早、中、晚投喂小球藻(Chlorellasp.)、等鞭金藻(Isochrysissp.)、角毛藻(Chaetocerossp.)和新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)混合饵料各1次，投喂后再次调试海水pH。每日统计青蛤死亡数，每3 d换水1/3。

图1 试验中海水酸化控制系统

分别于0、10、20、30、40 d，每组随机抽取4枚青蛤测定体态特征及生理代谢指标，解剖，90 ℃下烘干软体部至恒定质量。

采用封闭呼吸法测量耗氧率。每组取4枚青蛤放入4个呼吸瓶，另设空白对照，每组记录3个试验瓶和空白瓶的数据。青蛤开壳后计时，2 h后以碘量法测溶解氧质量浓度，按下式计算耗氧率(RR)：

RR/mg·(g·h)-1=V(C1-C2)/(m×t)

式中，V为呼吸瓶海水体积(L)，C1和C2代表试验前后水中溶解氧质量浓度(mg/L)，m为青蛤软体干质量(g)，t表示测试时间(h)。

利用次溴酸盐氧化法测氨氮含量。按下式计算排氨率(ER)及O∶N：

ER/mg·(g·h)-1=V(C1-C2)/(m×t)

O∶N=(RR/16)/(ER/14)

式中，V表示呼吸瓶海水体积(L)，C1和C2代表试验前后水中氨氮质量浓度(mg/L)，m为青蛤软体干质量(g)，t表示测试时间(h)。

1.3 数据分析

采用Excel 2013和SPSS 18软件进行数据分析。结果用平均数±标准差表示，进行单因素方差分析，Duncan显著性检验，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 试验期间pH、盐度和温度的变化

试验过程中，3个试验组海水pH为8.30±0.20、7.70±0.10和7.40±0.10(图2)。

图2 海水pH变化

海水温度在第14 d和18 d有两次剧烈下降，其他时间基本约为29 ℃。海水盐度变化稳定，为25.1～25.8(图3)。

图3 海水温度和盐度变化

2.2 青蛤死亡率

各试验组均有死亡个体，正常海水pH试验组死亡1枚。随着海水酸化强度的增强，累计死亡数呈上升趋势，表现出一定的正相关性。pH 7.40试验组在试验结束时死亡率达3.85%(图4)。

图4 不同pH梯度下各组青蛤的累积死亡个数

2.3 海水酸化对青蛤耗氧率的影响

在试验前30 d，pH 8.3组青蛤耗氧率呈逐渐增加趋势，但是差异不显著(P>0.05)(图5)。至第40 d时，其耗氧率有所下降，与第30 d和第20 d差异不显著(P>0.05)，与第0 d和10 d差异显著(P<0.05)。pH 7.7组青蛤耗氧率变化趋势与pH 8.3相似，前30 d耗氧率呈增加趋势，第30 d到达最大值，与第0、10 d和第40 d相比均差异显著(P>0.05)，第40 d耗氧率有所下降，此时与第30 d和第0 d比差异显著(P<0.05)，而与第20 d和第10 d比差异不显著(P>0.05)。在整个试验期间pH 7.4组青蛤的耗氧率均升高，10 d和0 d与40 d差异显著(P<0.05)。但是20、30 d和40 d之间差异不显著(P>0.05)

图5 不同pH对青蛤耗氧率的影响

“※”表示同一时间下各试验组间差异显著(P<0.05)，不同小写字母表示同一试验组不同时间下差异显著(P<0.05)，下同.

相同时间不同pH梯度下青蛤的耗氧率对比表明，除30 d外，其他各时间点试验组青蛤的耗氧率均随pH的降低而增加，大于对照组。在30 d时，pH 7.7组青蛤的耗氧率达最大值，而pH 7.4组降低，至40 d又呈递增，pH 7.4组最大。只有在第10 d时，pH 8.3和pH 7.4耗氧率差异性显著(P<0.05)。其他时间段4组的耗氧率差异均不显著(P>0.05)。

2.4 海水酸化对青蛤排氨率的影响

各试验组青蛤的排氨率随时间的延长而增加(图6)。方差分析结果表明，pH 8.3组各时间点的排氨率差异不显著(P>0.05)。pH 7.7组前30 d的排氨率差异不显著(P>0.05)，但第40 d时与前0 d和10 d的结果差异显著(P<0.05)。pH 7.4组的变化趋势与pH 7.7组类似，但第40 d只与第0 d的排氨率差异显著(P<0.05)。

图6 不同pH对青蛤排氨率的影

相同时间点各pH组青蛤的排氨率随pH的降低而增大，各处理组均大于对照组，但各组之间的差异不显著(P>0.05)。

2.5 酸化对青蛤O∶N比值的影响

pH 8.3组青蛤的O∶N比值先升后降，在20 d时最大。pH 7.7组青蛤的O∶N比值变化趋势与对照组相似，在第20 d时达最大值，而后逐渐减小(图7)。pH 7.4组青蛤的O∶N比值呈上升—下降—再上升的趋势，在第10 d达最大值，第30 d时达最小值。相同pH梯度下不同时间点的O∶N比值差异不显著(P>0.05)。

图7 不同pH对青蛤O∶N比值的影响

同一时间，不同pH胁迫下的O∶N比值表明，第10 d和40 d时的O∶N比值随pH降低而增加。而第30 d时正好相反，呈下降趋势。但同一时间点上不同pH胁迫下O∶N比值的差异不显著(P>0.05)。

3 讨 论

3.1 pH对青蛤耗氧率的影响

随着酸化时间的增加，酸化组青蛤的耗氧率逐渐高于对照组，这可能与青蛤自身提高呼吸代谢，抵抗外界不良环境有关。针对酸化的海水，海洋动物主要通过将能量转移至关键的生化进程，以达到酸碱补偿机制和离子内稳态，提高应对压力的能量需求[3-4]。Rosas等[5]认为，当外界环境发生变化时，凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)可通过血淋巴渗透调节和离子调节来适应这种变化，对虾会消耗体内储存的能量来应对环境变化，势必会导致机体代谢率的升高。从试验结果也不难看出，pH 7.7组自开始到30 d时呼吸代谢一直增加，说明机体在不断的适应环境变化带来的压力，至40 d时反而下降，更加说明了机体通过提高呼吸代谢正在逐步适应环境变化。当完全适应了严峻的环境后，呼吸代谢就会相对稳定。有学者[8]在研究柄海鞘(Styelaclava)耗氧率与pH的关系时发现，pH为7时柄海鞘的耗氧率最大，其呼吸代谢最旺盛，在pH 5～7的时柄海鞘的耗氧率随pH的升高而增大，pH大于7以后其耗氧率随pH的升高而降低。本试验随着酸化时间的增加耗氧率pH 7.4组>pH 7.7组>pH 8.3组，这与柄海鞘的研究成果[6]一致。Catarino等[7]发现，在19 d低温及低pH(pH 7.7、pH 7.4)暴露导致海胆(Paracentrotuslividus)代谢比对照组高，结果也与本次试验研究结果相符。但也存在着不同的研究结果，如当pH为6～9时，缢蛏(Sinonovaculaconstricta)的耗氧率变化并不明显[8]；日本黄姑鱼(Nibeajaponica)耗氧率影响变化很小[9]。随着pH梯度的逐渐降低，尖紫蛤(Soletellinaacuta)耗氧率逐渐降低[10]。这些结果表明，不同的试验对象其自身代谢不同，也可能与本次试验酸化时间较短有一定关系。目前由于受条件限制，所以研究海水酸化长期胁迫贝类对能量代谢造成影响的文献尚未见报道。

3.2 pH对青蛤排氨率的影响

随着酸化时间的延长，试验组的排氨率均呈逐渐递增的状态，且均大于对照组，排氨率pH 7.4组>pH 7.7组>pH 8.3组。Fernández-Reiriz 等[11]研究发现，在酸化条件下，槽蛤仔(Ruditapesdecussatus)幼体氨排泄率较正常情况下增加；Thomsen等[12]研究发现，贝类在严重酸化条件下生长减慢的主要原因是细胞能量需求的增加和氮损失的协同作用。本研究也论证了这个观点，针对pH的降低导致排氨率反而逐渐升高这一现象，有的学者认为同论述耗氧率相同，排氨率的这种逐渐增长的状态与自身抵抗外界不良环境有关。唐贤明等[13]指出, pH对鱼的刺激直接导致鱼代谢失调，而耗氧率、排氨率的增加正是鱼产生应激反应、对不良环境进行积极对抗的结果，证明在酸化胁迫的情况下，出现较高的排氨率是自身抵抗不良环境的表现。然而也存在不同的报道，刘建业等[14]在研究盐度和pH对合浦珠母贝(Pinctadafucata)耗氧率和排氨率的影响中指出，在pH 5～9随pH的变化, 其排氨率呈先升后降趋势, 在pH为8时达到最大，过高或过低的pH均会降低排氨率。同耗氧率相同，延长酸化时间，贝类排氨率可能降到一个固定值，最后趋于稳定。单纯研究海洋酸化对贝类排氨率影响的文献较少，大多都夹杂温度、盐度等共同作用下的能量代谢影响，鉴于条件限制，几乎没有长期对某一贝类进行酸化研究其能量代谢的报道。作为整个海洋生态系统来说，具有多样性和复杂性，因此单一的较短时间的对某一海洋物种进行酸化研究充满了局限性和偶然性，未来要对固定对象进行长期的探究，客观的探究海水酸化给海洋生态带来的危害。

3.3 pH对青蛤O∶N比值影响

尽管尚未证明O∶N比值差异值对机体的生长速率和个体大小有直接的影响，但是诸多的迹象表明O∶N比值的变化与机体所受的压力密切相关[15]。在酸化初期，由于酸化带来的不良生长环境，机体产生应激反应，伴随着耗氧率和排氨率的增加，O∶N比值也会同样增加。但到了第30 d出现明显的下降。这一现象与大多学者的研究相符。金春华对温度和盐度对青蛤O∶N比值的影响表明，在适宜的范围内升高温度和盐度O∶N比值会随之增加，超过机体耐受范围后反而会逐渐减小[16]。范德鹏等[17-18]也都证明了这点，当生存环境突变，机体就会相应产生应激性，代谢能力出现短暂升高，然后逐渐降低。本研究青蛤受到较低的酸化胁迫后开始出现短期的应激抵抗，但随着胁迫时间增加，生理代谢受到抑制，O∶N比值开始下降，试验组比对照组低，这也进一步说明较低的pH抑制青蛤的代谢，从而迫使青蛤要消耗自身体内蛋白质来为其新陈代谢供能。Mayzaud[19]认为, 机体以蛋白质代谢为主导地位时O∶N比值较低(7.0～9.3); 当脂肪和碳水化合物代谢占主导地位时O∶N比值通常大于24。本文中的O∶N比值均大于24，可能是因为试验温度较高，导致能量代谢值整体偏高。

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EffectofOceanAcidificationonRespirationRateandExcretionRateinClamCyclinasinensis

GAO Shan1, LIANG Jian1, LI Yongren1, MA Yunkun1, GUO Yongjun1, YAN Xiwu2

( 1.Tianjin Key Lab of Aqua-Ecology and Aquaculture, College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China；2. Liaoning Engineering Research Center Breeding of Shellfish, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China )

The effects of pH 7.5±0.05 and pH 7.4±0.05 regulated by pure air and CO2levels on oxygen consumption rate, excretion rate and O∶N were studied in clamCyclinasinensiswith body weight of (11.362±0.7) g at water temperatare of (29.5±0.5) ℃ and a salinity of 25. The results showed that the cumulative mortality was found to be increased with the increase in seawater acidification, and that the order of mortality was expressed as pH 7.4>pH 7.7>pH 8.3. Respiration rate was decreased with the increase in pH, while lower pH led to promoted the excretion rate. The O∶N was shown to be decreased with the decrease in pH value and the ocean acidification in a certain range affected the survival and metabolism of the clam, but these effects were not fatal to the clam. The clam regulated metabolism to adapt to marine acidification, and the findings provides a basic theory for the adaptation of the clam to ocean acidification.

ocean acidification;Cyclinasinensis; respiration rate; excretion rate; O∶N

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.06.011

S968.31

A

1003-1111(2017)06-0758-05

2016-11-08；

2017-01-06.

国家“十二五”现代农业产业技术体系专项(CARS-48)；天津市农业科技成果转化与推广项目(201502350)；天津市基础研究计划项目(14JCTPJC00521)；天津市应用基础与前沿技术研究计划项目(15JCYBJC30400)；天津市科技特派员项目(16JCTPJC46200).

高山(1990-)，男，硕士研究生；研究方向：海水酸化对贝类的影响.E-mail:331268746@qq.com.通讯作者：郭永军(1969-)，男，研究员；研究方向：水产动物病害及免疫学. E-mail:guoyongjun@tjau.edu.cn.