李菲菲

（淄博市中西医结合医院 肾内科，山东 淄博 255026）

HPLC检测血管紧张素转化酶抑制剂活性

李菲菲

（淄博市中西医结合医院 肾内科，山东 淄博 255026）

建立高效液相色谱法测定血管紧张素转化酶抑制剂活性的方法。方法：依血管紧张素转化酶能够催化马尿酰-组氨酰-亮氨酸分解为马尿酸和组氨酰-亮氨酸，通过测定马尿酸的降解量，测定血管紧张素活化酶抑制剂活性。结果：Shim-pack VP-ODS C18色谱柱250mm×4.6mm，填料粒径5μm，柱温为30℃，流动相：乙腈（0.1%冰乙酸，0.1%三乙胺）-双蒸水（0.1%冰乙酸，0.1%三乙胺）（28∶72），流速为 0.8mL·min-1，检测波长为228nm，在0.2～500μg·mL-1范围内马尿酸浓度与其响应值呈良好的线性关系（R=0.9999），检测限为0.02μg·mL-1，马尿酸的回收率为97.51%～101.08%，RSD值为0.20%～1.35%。结论：本方法能够准确、精密的测定血管紧张素转化酶抑制剂活性，为血管紧张素转化酶抑制剂的研发应用提供准确可靠的手段。

高效液相色谱；血管紧张素转化酶抑制剂；马尿酸

血管紧张素是一种肽类物质，具有极强的缩血管作用，参与血液和体液调节，主要受血管紧张素转化酶的调节，血管紧张素转化酶能够将活性较弱的血管紧张素Ⅰ迅速转化为升压效果显著的血管紧张素Ⅱ，从而使血压上升。血管紧张素主要来源于肾素，而在正常情况下人体内的肾素分泌很少，因此，血管紧张素对机体的血压影响并不显著，而只有在机体大量失血或肾脏出现问题、透析等情况下血管紧张素才会生成增多，从而促使血压升高[1]。在该过程中血管紧张素转化酶起到了关键的作用，因此，越来越多的医药工作者对血管紧张素转化酶的抑制药物进行研究，以期能够抑制血管紧张素转化酶的活性，从而抑制血管紧张素转化为活性更高的血管紧张素，而血管紧张素抑制剂的活性则是其重要的衡量标准，因此，必须建立快速、准确的检测血管紧张素转化酶抑制剂活性的方法[2]。

目前，测定血管紧张素转化酶抑制剂常用方法主要有：（1）紫外-可见分光光度法；（2）高效毛细管电泳法；（3）高效液相色谱法。紫外-可见分光光度法是将待测溶液于228nm下测定其吸光度，由于该方法无分离效果，测试结果多偏高；毛细管电泳法由于进样量小，因此，其灵敏度较低[3-5]；本文参考其他研究者检测方法，并在其基础上进一步优化，得出了一种利用高效液相色谱法准确测定血管紧张素转化酶活性的方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

岛津LC-20AT高效液相色谱仪，配备SIL-20A自动进样器、Labsolution色谱工作站、配备SPD-M20a检测器；生化培养箱、取液器。

马尿酸（批号：140738-200501中国食品药品检定研究院）；马尿酰-组氨酸-亮氨酸（sigma公司）；血管紧张素转化酶（Sigma公司）；贝那普利（Sigma公司）；乙腈（色谱级）；三乙胺、硼酸、硼砂、NaCl均为分析纯。

1.2 色谱条件

Shim-pack VP-ODS C18色谱柱250mm×4.6mm，填料粒径5μm，柱温为30℃，流动相：乙腈（0.1%冰乙酸，0.1%三乙胺）-双蒸水（0.1%冰乙酸，0.1%三乙胺）（28：72），流速为 0.8mL·min-1，检测波长为228nm，进样量 10μL。

1.3 测定原理

血管紧张素转化酶能够催化马尿酰-组氨酸-亮氨酸分解为马尿酸和组氨酸-亮氨酸组成的二肽。当有血管紧张素转化酶抑制剂存在时，血管紧张素转化酶的活性受到抑制，催化马尿酰-组氨酸-亮氨酸分解为马尿酸和组氨酸-亮氨酸二肽的能力下降，可以通过检测马尿酸的量来衡量血管紧张素转化酶活性受抑制的程度。可以通过下式计算血管紧张素转化酶活性受抑制的程度[3]。

式中 f1：未加入血管紧张素转化酶抑制剂溶液中马尿酸的响应值；f2：为加入血管紧张素转化酶抑制剂溶液中马尿酸的响应值。

1.4 供试品制备

0.1 mol·L-1硼酸溶液 称取硼酸适量，用pH值8.3的0.3mol·L-1NaCl溶液溶解并稀释制成每1L含硼酸0.1mol的溶液。

贝那普利溶液 称取适量的贝那普利用0.1mol·L-1硼酸溶液配制成一定浓度的溶液，再精密量取适量，用0.1mol·L-1硼酸溶液稀释至所需浓度。

血管紧张素转化酶 将2U的血管紧张素转化酶溶于20ml 0.1mol·L-1硼酸溶液中，摇匀，即得。

马尿酰-组氨酸-亮氨酸溶液 取马尿酰-组氨酸-亮氨酸适量，用0.1mol·L-1硼酸溶液稀释制成 0.5mmol·L-1的溶液。

马尿酸对照溶液配制 取马尿酸对照品适量，用 0.1mol·L-1硼酸溶液配制成 1mmol·L-1的马尿酸对照品储备溶液，再用0.1mol·L-1硼酸溶液稀释成不同浓度的马尿酸标准溶液。

反应溶液 取适量的贝那普利溶液用0.1mol·L-1硼酸溶液稀释成不同浓度，分别取20μL，加入10μL血管紧张素转化酶溶液，于37℃下平衡5min，加入马尿酰-组氨酸-亮氨酸溶液100μL，于37℃恒温条件下反应30min，用1.0mol·L-1的HCl 170μL终止反应。同法制备用0.1mol·L-1H3BO3溶液代替贝那普利溶液的反应液作为混合溶液。

空白溶液 取0.1mol·L-1硼酸溶液作为空白溶液。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

取马尿酸适量，用0.1mol·L-1H3BO3溶液溶解并稀释成 10μg·mL-1的溶液，以 0.1mol·L-1H3BO3溶液作空白溶液。在200～400nm波长范围内进行光谱扫描，结果见图1。

图1 马尿酸紫外吸收扫描图Fig.1 UV absorption spectra of hippuric acid

由图1可见，马尿酸在200nm与228nm处有最大吸收，由于200nm为末端吸收，检测时干扰较大，因此选择228nm作为检测波长。

2.2 色谱分析

通过上述色谱条件采集的典型色谱图（图2）可知，马尿酸与三肽能有效分离，且加入贝那普利的溶液比不加入贝那普利溶液马尿酸的峰面积减小，说明该条件适合血管紧张素抑制没测定。

图2 血管紧张素活化酶抑制剂活性检测典型色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of activity detection of angiotensin I-converting enzyme

2.3 线性关系和检测线

马尿酸对照溶液配制：取马尿酸对照品适量，用0.1mol·L-1H3BO3溶液配制成 1mmol·L-1的马尿酸对照品储备溶液，再用0.1mol·L-1H3BO3溶液稀释成不同浓度的马尿酸标准溶液。以样品浓度为横坐标，分面积为纵坐标，制作标准曲线，所得线性回归方程为A=31.89C-28.34，相关系数0.9999。结果表明，马尿酸在0.2～500μg·mL-1的浓度范围内线性关系良好，因此在该浓度范围内，通过检测马尿酸的含量可以间接反映血管紧张素被抑制的程度。以S/N为3为检测限浓度，测得检测限的浓度为0.02μg·mL-1，该方法检出能力能够满足样品的分析。

2.4 精密度实验

取相同浓度（线性关系100%溶液）的供试品溶液，连续进样6次，测得马尿酸峰面积的RSD为0.046%，表明该仪器精密度良好。

2.5 重复性实验

配制6份相同浓度的供试品溶液，分别进样，计算6次检测峰面积RSD值，6次测定结果峰面积RSD值为0.92%，说明该检测方法重复性良好。

2.6 回收率实验

在已知浓度的样品中加入不同量的马尿酸，配制3个不同浓度，作为回收率供试品溶液，分别测定样品溶液和混合液中马尿酸的浓度，依据测定结果计算测得量与加入量的比值，计算回收率值，结果显示，马尿酸回收率为97.51%～101.08%，RSD值为0.20%～1.35%，说明该方法能够准确测定该物质。

表1 马尿酸回收率实验Tab.1 Recovery experiment of hippuric acid

3 结论

血管紧张素为人体内重要的血管活性物质，而血管紧张素活化酶是促使血管紧张素发挥作用必不可少的物质，为控制血管紧张素带给人体的不良反应，血管紧张素转化酶抑制剂被不断发明[6-8]。本研究为高效液相色谱法快速检测血管紧张素转化酶抑制剂的方法，该方法具有准确、精密的特点，能够快速的测定血管紧张素转化酶抑制剂的活性，为血管紧张素转化酶抑制剂产品的开发应用提供依据。

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Determination of angiotensin converting enzyme inhibitor activity by HPLC

LI Fei-fei
（ Urology Department，Zibo Traditional Chinese and Western Medicine Hospital，Zibo 255026，China）

objective A high performance liquid chromatographic method to determine angiotensin-converting enzyme inhibitor activity in vitro was established.Method N-hippuryl-his-leu can be devided into hippuric acid and His-Leu by Angiotensin Converting Enzyme，it can be used for determination of angiotensin inhibitor activity.Result hippuric acid was separated on an Shim-pack VP-ODS C18column （250mm×4.6mm,5μm）using a mobile phase consisting of acetonitrile and water（28∶72，V/V,containing 0.1 glacial acetic acid）at a flow rate of 0.8mL·min-1and detected at 228nm.A good linear relationship was observed for hippuric acid over the concentration range of 0.2 to 500 μg·mL-1with a correlation coefficient of 0.9999.The average spike recovery rates of hippuric acid were 97.51%～101.08%with a relative standard deviation （RSD）of 0.20%～1.35%.Conclusion The HPLC method was accurately and precisely,accurate and suitable for the analysis of ACE inhibitory activity,and provides an accurate and reliable means for the research and application of angiotensin converting enzyme inhibitors.

high performance liquid chromatography（HPLC）；angiotensin I-converting enzyme hippuric acid

R-331

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20171129

2017-07-21

李菲菲（1982-），女，主治医师，主要研究方向：肾内科血液净化方向。