曾希珂,张 喻*,罗凤莲,王 燕

(1.湖南农业大学 食品科学技术学院,湖南 长沙 410128;2.国家蔬菜加工技术研发分中心,湖南 长沙 410128;3.食品科学与生物技术湖南省重点实验室,湖南 长沙 410128)

多菌种发酵辣椒汁培养基配方的优化

曾希珂1,2,3,张 喻1,2,3*,罗凤莲1,2,3,王 燕1,2,3

(1.湖南农业大学 食品科学技术学院,湖南 长沙 410128;2.国家蔬菜加工技术研发分中心,湖南 长沙 410128;3.食品科学与生物技术湖南省重点实验室,湖南 长沙 410128)

以肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)为试验菌株,采用鲜辣椒汁为基础培养基,通过单因素试验确定最佳碳源、氮源和无机盐及其添加量。在此基础上,以上4种乳酸菌按照1∶1∶1∶1的配比混合后作为试验菌株,采用正交试验设计优化,多菌种发酵鲜辣椒汁培养基的配方。结果表明,最佳培养基配方为葡萄糖的添加量为4%,酵母浸膏的添加量为3%,磷酸氢二钾的添加量为0.2%,优化后培养基中乳酸菌浓度为8.45×109CFU/mL,增殖效果良好。该研究为剁辣椒的产业化生产奠定了基础。

多菌种;发酵鲜辣椒汁;培养基;正交试验优化

乳酸菌是一种常见的益生菌,因其具有促进机体生长、降胆固醇和增强免疫力等特有的保健功能[1-3],在食品中的应用得到迅速发展。乳酸菌发酵食品主要包括发酵蔬菜、酸奶和发酵肉制品等,受到许多消费者的青睐[4]。目前,国内主要利用纯种乳酸菌生产辣椒酱[5]、泡菜[6]等,与此同时,多菌种混合发酵生产发酵辣椒制品也受到研究者越来越多的关注。JI X等[7]研究发现,嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidlophilus)和瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)混合发酵产酸速度明显大于自然发酵,并能提高产品的脆度及香味。杨玉新等[8]将活化好的保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、啤酒酵母及醋酸杆菌(Acetobacter aceti)按2∶2∶1的配比接入辣椒酱后,制成的产品色泽鲜红,香味浓郁。

剁辣椒的传统制作工艺主要是采用高盐自然发酵,发酵周期长,易受杂菌污染从而导致亚硝酸盐含量偏高,严重影响了食品的健康与安全性[9]。根据自然界的多菌群发酵原理,本研究将肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)4种乳酸菌复配后接种至新鲜辣椒汁中进行研究。并对培养基的碳源、氮源、无机盐种类及浓度进行优化,从而确定多菌种发酵辣椒汁培养基配方的最优条件,以期为多菌种发酵剂的制备以及开发新型发酵辣椒产品提供理论依据,对于今后剁辣椒的产业化生产具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料与菌种

红辣椒:湘辣4号,红色,果长15～18 cm,新鲜,无病虫害,购于湖南农业大学东之源超市。

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ATCC-8014、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)CICC-21861,发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)ATCC-11739,嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)ATCC-4356:广东省微生物菌种保藏中心(GuangdongMicrobialCultureCenter,GDMCC)。

1.1.2 培养基

MRS液体培养基:酪蛋白胨10.0 g、牛肉浸取物10.0 g、酵母浸膏5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二铵2.0g、吐温80 1.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g、蒸馏水1.0 L。

1.1.3 化学试剂

葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、胰蛋白胨、蛋白胨、酵母浸膏、牛肉膏、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、吐温-80、乙酸钠、琼脂粉(均为分析纯或生化试剂):国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

DHP-9272A型恒温培养箱:上海飞越实验仪器有限公司;LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌锅:上海申安医疗器械厂;CJ-2D型净化工作台:天津市泰斯特仪器有限公司;CP214型电子天平:奥豪斯仪器(上海)有限公司;722S型可见分光光度计:上海精密科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种的活化

将装有冻干乳酸菌粉的安碚管破管,吸取0.5 mL左右的MRS液体培养基注入管中,溶解干粉,然后接种在5 mL的MRS液体培养基中,于37℃的条件下静置培养24～48 h,连续转管活化2～3代后,以4种乳酸菌按1∶1∶1∶1的配比、接种量5%接入MRS液体培养基,于37℃恒温培养24 h得到发酵种子液[10]。

1.3.2 菌株生长曲线的测定

待菌株活化后,接种1 mL种子液于装有MRS液体培养基的无菌试管中。将已接种的试管置于37℃条件下静置培养48 h,每2 h在分光光度计波长600 nm处测定一次其OD600nm值,以空白培养基作对照。然后以OD600nm值为纵坐标,生长时间为横坐标分别绘制4种乳酸菌的生长曲线。

1.3.3 菌浓度的测定

采用平板菌落计数法[11]进行测定。

1.3.4 鲜辣椒汁基础培养基

原料选择(挑选新鲜、无病虫害的鲜辣椒)→清洗→打浆→过滤→调节碳、氮源和无机盐(添加质量分数3%的葡萄糖作为碳源、质量分数3%的酵母浸膏作为氮源、质量分数0.2%的磷酸氢二钾作为无机盐)→混合溶解→调配(调节pH5～6)→灭菌(121℃灭菌20 min)→冷却至室温→鲜辣椒汁培养基

1.3.5 培养基成分的优化

(1)不同碳源及其添加量对乳酸菌生长的影响

在原辣椒汁培养基中,分别选择葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖,作为其中的碳源,添加量3%,其余成分固定。以4种乳酸菌按1∶1∶1∶1的配比、接种量5%接入培养基中,于37 ℃恒温培养24 h后测定其菌浓度,根据菌株的生长情况选择最佳碳源。以1%、2%、3%、4%、5%等5个浓度梯度,测定不同碳源添加量对乳酸菌浓度的影响。

(2)不同氮源及其添加量对乳酸菌生长的影响

在原辣椒汁培养基中,分别选择胰蛋白胨、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏,作为其中的氮源,添加量2%,其余成分固定。以4种乳酸菌按1∶1∶1∶1的配比、接种量5%接入培养基中,于37℃恒温培养24 h后测定其菌浓度,根据菌株的生长情况选择最佳氮源。以1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%5个浓度梯度,测定不同氮源添加量对不同乳酸菌浓度的影响。

(3)不同无机盐及其添加量对乳酸菌生长的影响

在原辣椒汁培养基中,分别选择K2HPO4、Na2HPO4、MgSO4、FeSO4,作为其中的无机盐,添加量0.4%,其余成分固定。以4种乳酸菌按1∶1∶1∶1的配比、接种量5%接入培养基中,于37℃恒温培养24 h后测定其菌浓度,根据菌株的生长情况选择最佳无机盐。以0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%5个浓度梯度,测定不同无机盐添加量对乳酸菌浓度的影响。

(4)正交试验优化培养基配方

在碳源、氮源、无机盐种类及添加量确定的情况下,以葡萄糖、酵母浸膏和磷酸氢二钾的浓度为影响因素,菌浓度为评价指标,采用4种乳酸菌按1∶1∶1∶1的配比混合后作为试验菌种,以接种量5%接入培养基中,于37℃恒温培养24h后测定其菌浓度。设计3因素3水平L9(33)的正交试验,优化培养基组分。正交试验因素与水平见表1。

表1 多菌种混合发酵辣椒汁培养基配方优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for optimization of medium formula of multi-strains fermentation of pepper juice

1.3.6 数据处理方法

采用SPSS19.0数据处理软件、EXCEL软件进行数据处理分析。

2 结果与分析

2.1 不同乳酸菌生长曲线的测定结果

由图1可知,四种菌株的生长曲线类似。四种菌株基本在培养2～4 h后进入对数生长期,在对数期发酵乳杆菌和肠膜明串珠菌的生长不如植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌。植物乳杆菌、发酵乳杆菌和嗜酸乳杆菌在第12小时后进入稳定生长期,而肠膜明串珠菌在15 h后进入稳定生长期。四种菌株的生长旺盛期为2～15h,说明此时段其生长代谢旺盛,适宜接种。

图1 不同乳酸菌的生长曲线Fig.1 Growth curves of different lactic acid bacteria

2.2 最佳碳源及其添加量的确定

不同碳源葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖对乳酸菌的生长情况如图2所示。

图2 不同碳源对菌株生长的影响Fig.2 Effects of different carbon sources on strains growth

由图2可知,当葡萄糖作为碳源时,菌浓度最高,可达1.859×109CFU/mL,且显著高于其他糖类作为碳源时的菌浓度(P＜0.05)。其中以乳糖为碳源时的菌浓度最低,仅为0.985×109CFU/mL。说明以葡萄糖为碳源时,乳酸菌的菌浓度较高,适宜菌株的生长。而当蔗糖、麦芽糖和乳糖作为生长碳源时,菌浓度较低,菌株生长缓慢,这可能是由于乳酸菌缺乏分解双糖的酶,不能利用较复杂的碳水化合物,因此选择葡萄糖为最佳碳源[12]。田菊梅等[13]比较了葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖和核糖作为碳源时对低温混合菌增殖效果的影响,虽然都有一定的促进作用,但综合考虑确定葡萄糖作为最佳碳源。

由图3可知,随着葡萄糖添加量的增加,菌浓度先增大后减小。当葡萄糖添加量为4%时,乳酸菌的菌浓度最大。继续增加葡萄糖的添加量,菌浓度反而下降,可能是由于葡萄糖浓度过高会导致菌体失水从而无法复原,因此当葡萄糖添加量为4%时,乳酸菌生长的最好,为最佳添加量。

图3 不同葡萄糖添加量对菌株生长的影响Fig.3 Effects of different glucose concentration on strains growth

2.3 最佳氮源及其添加量的确定

不同氮源胰蛋白胨、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏对乳酸菌的生长情况如图4所示。

图4 不同氮源对菌株生长的影响Fig.4 Effects of different nitrogen sources on strains growth

由图4可知,培养基中使用酵母浸膏为氮源时,乳酸菌菌株生长较好,菌浓度高达3.283×109CFU/mL,显著高于其他氮源(P＜0.05)。这可能是由于酵母浸膏富含蛋白质,氨基酸和维生素等营养物质,在生长过程中给乳酸菌提供了充足的氮源和所需的微量元素,促进其生长繁殖[14-15]。胰蛋白胨和蛋白胨作为氮源时菌浓度次之,且二者相差不大。而牛肉膏作为氮源时菌浓度最低。说明单独添加牛肉膏不利于乳酸菌的增殖,无法快速的促进菌株的生长。这与杨杰等[16]选择0.53%的酵母粉作为绿豆乳发酵专用增殖培养基的结果类似,优化后较普通基础培养基中的活菌数提高了8.7倍。因此选择酵母浸膏为最佳氮源。

由图5可知,随着酵母浸膏添加量的增加,乳酸菌的菌浓度先增大后减小。当酵母浸膏添加量为2.5%时,菌浓度最大,活菌数最多,长势较优。而当酵母浸膏添加量＞2.5%时,菌浓度开始下降。这与林巧[17]发现不宜使用过高浓度酵母粉。因此选择酵母浸膏的最佳添加量为2.5%。

图5 不同酵母浸膏添加量对菌株生长的影响Fig.5 Effects of different yeast extract concentration on strains growth

2.4 最佳无机盐及其添加量的确定

不同无机盐磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁和硫酸亚铁对乳酸菌的生长情况如图6所示。

图6 不同无机盐对菌株生长的影响Fig.6 Effects of different inorganic salts on strains growth

图7 不同K2HPO4添加量对菌株生长的影响Fig.7 Effects of different K2HPO4concentration on strains growth

无机盐是细菌增殖不可或缺的重要物质,其主要作用是能维持细胞的渗透压,此外一些无机盐离子还对细菌体内的酶产生激活作用,促进乳酸菌的生长代谢[18]。由图6可知,在以磷酸氢二钾为无机盐的培养基中菌浓度较高,浓度为2.014 3×109CFU/mL,其次为硫酸镁,但二者相差不明显(P＞0.05)。说明微量元素能促进植物乳杆菌的增殖,与张瑶等[19]的研究结果类似。而磷酸氢二钠和硫酸亚铁对乳酸菌的增殖效果不大。因此,选择磷酸氢二钾为最佳无机盐。

由图7可知,随着磷酸氢二钾添加量的增加,乳酸菌浓度先增大后减小。当磷酸氢二钾的添加量增至0.3%时,菌浓度达到最高值,为4.83×109CFU/mL。随着磷酸氢二钾添加量的继续增加,乳酸菌的菌浓度逐渐下降,说明磷酸氢二钾质量分数为0.3%时为最佳添加量。

2.5 多菌种发酵辣椒汁培养基的优化

在单因素试验的基础上,以4种乳酸菌按肠膜明串珠菌∶植物乳杆菌∶发酵乳杆菌∶嗜酸乳杆菌=1∶1∶1∶1的配比混合后作为试验菌株,接种量5%接入培养基中,于37℃恒温培养24 h后测定其菌浓度。设计3因素3水平L9(33)的正交试验,以葡萄糖、酵母浸膏和磷酸氢二钾的浓度为自变量,乳酸菌浓度为评价指标对培养基进行优化,正交试验结果与分析见表2,方差分析结果见表3。

表2 多菌种混合发酵辣椒汁培养基配方优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for optimization of medium formula of multi-strains fermentation of pepper juice

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments result

由表2可知,通过计算极差值可以得出各因素对多菌种的生长影响主次顺序为葡萄糖＞酵母浸膏＞磷酸氢二钾,说明葡萄糖的添加量是影响菌浓度的主要因素,其次是酵母浸膏,而磷酸氢二钾对菌浓度的影响最小,多菌种的最佳培养基组合为A2B3C1。在此最佳培养基条件下进行验证试验,得到培养基中多菌种的乳酸菌浓度为8.45×109CFU/mL。故多菌种发酵辣椒汁培养基配方的最佳组合为葡萄糖添加量4%,酵母浸膏添加量3%,磷酸氢二钾添加量0.2%。

由表3可知,葡萄糖和酵母浸膏添加量对混合菌株的菌浓度具有显著影响(P＜0.05),而磷酸氢二钾添加量的影响不显著(P＞0.05)。方差分析结果与极差分析结果一致。

3 结论

本研究以肠膜明串珠菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌和嗜酸乳杆菌为试验菌株,辣椒汁为原料,通过单因素和正交试验设计确定了优化后培养基的最佳配比为:葡萄糖添加量4%,酵母浸膏添加量3%,磷酸氢二钾添加量0.2%,优化后培养基中多菌种的菌浓度为8.45×109CFU/mL,比优化前的6.3×108CFU/mL提高了一个数量级,增幅显著,说明此培养基适用于多菌种的混合培养。

本研究选用辣椒汁作为基础培养基,并对培养基的碳源、氮源、无机盐种类及浓度进行了优化。不仅有效的提高了菌浓度,而且大大节约了成本,同时能够使多菌种快速的适应发酵内环境并迅速产酸,为多菌种发酵剂培养基的进一步研究提供了理论依据,同时也为多菌种发酵辣椒的生产奠定了基础。

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ZENG Xike1,2,3,ZHANG Yu1,2,3*,LUO Fenglian1,2,3,WANG Yan1,2,3
(1.College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China;2.National R&D Center for Vegetable Processing,Changsha 410128,China;3.Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology,Changsha 410128,China)

TS255.53

0254-5071(2017)11-0091-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.020

2017-08-15

湖南省科技重大专项子项目(2015NK1003)

曾希珂(1993-),女,硕士研究生,研究方向为农产品加工与贮藏。

*通讯作者:张 喻(1972-),女,教授,博士,研究方向为农产品加工与贮藏。