， ， ， ， (.云南农业大学草业科学系， 昆明 6500； .云南省草地动物研究院， 昆明 6500)

·研究报告·

青藏高原野生百脉根种子休眠及萌发特性的研究

任健1，代微然1，宋丽梅1，欧阳青2，马向丽1
(1.云南农业大学草业科学系， 昆明 650201； 2.云南省草地动物研究院， 昆明 650220)

百脉根(LotuscorniculatusL.)是一种富含营养物质的豆科牧草，适应酸性、干旱及贫瘠的土壤，在我国分布广泛，然而种子的休眠特性限制了它的利用。为此，以青藏高原亚高山草甸的野生百脉根种子为试验材料，通过擦破种皮、化学腐蚀、低温冷冻等方法研究打破种子休眠的办法。研究结果表明，野生百脉根种子的硬实率高达92.3%，种皮厚度为(65.63±2.26)μm，比对照高出60.4% (plt;0.01) ，可见野生百脉根种子以种皮厚、透水性差为特点。试验还发现，擦破种皮后，种子的发芽率由8.7%提高到85%；浓度为98%的浓硫酸浸泡5，15，25 min均能有效地降低种子的硬实率，提高发芽率，其中以15，25 min处理效果最好，相比而言，浓度为40%的NaOH处理效果不明显。GA3、低温湿沉积+GA3及-4 ℃，-20 ℃及液氮超低温冷冻能显著提高发芽率。

百脉根； 休眠； 硬实； 发芽率； 平均发芽天数

种子萌发涉及到形态、生理生化的变化，是一个复杂的过程。在自然界，一些具有活力的种子，在适宜的环境条件下仍然不能萌发，处于休眠状态。休眠是植物对环境的一种适应，通过休眠使得植物能度过干旱、高温等不良环境[1]。种子休眠的机理主要是种皮透性差、胚没有完全成熟等引起的休眠。对一些豆科植物来说，种皮的不透性是造成种子休眠的主要原因。

百脉根(LotuscorniculatusL.)是豆科百脉根属多年生牧草，又名牛角花、五叶草，原产于欧亚温暖地区，在世界各地均有广泛种植，在我国主要分布在华东、华中、西南及西北[2]。在青藏高原东缘的亚高山草地上，百脉根是分布最广的草种之一，营养价值高，适口性好，再生能力强，具有耐牧的特点，可青贮、刈割及放牧利用，是牛、马、兔等家畜的优良牧草[3]，然而种子的发芽率较低，出苗率差。尽管目前国内已在百脉根遗传[4]、抗旱性[5]等方面展开研究，但对野生百脉根种子硬实处理方法的研究少见报道。本研究以青藏高原天然草地上采集的野生百脉根种子为试验材料，通过测定种皮厚度，利用酸、碱、液氮冷冻等方法了解种子休眠的原因，并筛选出打破种子休眠的适宜处理方法，为野生百脉根资源的利用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为野生百脉根种子，种子于2011年秋采自云南省香格里拉县海拔3 150～3 220 m的亚高山草甸(27°29′59.8′′N 、99°51′18.7′′E)，当地年均降雨量为849.8 mm，年均温为5.8 ℃。采收后，混匀，常温贮藏于实验室(相对湿度40%～60%)。从2012年8—10月，参照国际种子检验规程[6]进行种子发芽实验。试验中，随机取100粒种子置于纸床，每个处理重复3次，置于人工气候箱25 ℃下恒温(变温处理中白天29 ℃，晚上25 ℃)培养，光照强度180μmol/(m·s)，光照时间为8 h/d，每天更换蒸馏水。每天记录种子发芽数，以胚根伸出种皮作为种子萌发的标准。第8天统计发芽率，并计算平均发芽天数[7]。

发芽率(%)=规定时间内种子发芽数/供试种子总数×100%；

平均发芽天数=∑(Gt×Dt)/∑Gt；

式中，Gt为逐日发芽数(粒)；Dt为相应的发芽天数(d)。

1.2 方 法

1.2.1 种皮厚度、种子千粒重、硬实率的测定

种皮厚度：先利用冷冻切片机(SLEE，德国)对干种子切片，然后在显微镜下(DM 2000, 德国)进行测量，与没有休眠的百脉根品种进行种皮的比较。

种子千粒重：从净种子中随机数1 000粒种子称重，重复3次(精确到0.01 g)。

种子硬实率：随机取100粒野生百脉根种子，在25 ℃下用100 mL蒸馏水浸种48 h，统计未吸胀种子的粒数，计算硬实率。重复3次，以下一致。

1.2.2 擦破种皮(Sc)处理

取2张木工用80目砂布，将种子置于其间，2张砂布在水平面上作相对旋转运动进行磨擦，至种皮发毛，然后在25 ℃恒温和29 ℃/25 ℃变温条件下进行发芽试验。

1.2.3 强酸、强碱处理

将种子放置在100 mL烧杯中，分别加入98%浓硫酸、49%硫酸对种子进行酸蚀处理，处理过程中，不断搅拌，以防结块，处理时间分别为5，15，25 min。处理后，立即用蒸馏水反复冲洗种子，然后进行发芽试验。

将种子放入100 mL烧杯中，加入40%的氢氧化钠溶液没过种子，分别浸泡10，20，30 min。用蒸馏水反复冲洗，然后进行发芽试验。

1.2.4 低温沉积、低温和超低温冷冻处理

取适量种子置于冰箱不同的冷藏室中，贮藏室温度分别为4，-4，-20 ℃，在4 ℃贮藏室中，种子分别进行干沉积和湿沉积处理。处理8周后取出，在室温下解冻，以未处理的种子作为对照，进行发芽试验。

用纸袋将种子包起来，在液氮中处理5，10，15，20 min，室温下解冻后置于25 ℃下进行发芽试验。

1.2.5 赤霉素(GA3)处理

用浓度为50，100，200 mg/L GA3浸泡种子24 h后，用蒸馏水反复冲洗，然后进行发芽试验。另外，取部分擦破种皮的种子、低温湿沉积后的种子分别与GA3进行复合处理，GA3的浓度分别为50，100，200 mg/L，然后在25 ℃下开展发芽试验。

1.2.6 温水浸种处理

取适量种子分别在40 ℃温水中浸种3，5，10，60，120，180 min，以及80 ℃温水浸种3，5，10 min后，取出冷却至室温，然后进行发芽试验。

1.3 数据分析与处理

试验数据利用SPSS 12.0统计软件进行方差分析，不同处理之间的差异性比较采用SNK进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 种子千粒重、硬实率

试验结果表明，野生百脉根种子千粒重为1.12 g ，硬实率高达92.3%，说明野生百脉根种子自然状态下硬实率较高。从种子切片来看，外表皮是排列紧密的栅栏组织，种皮的厚度为(65.63±2.26)μm，与休眠程度低的种子相比，种皮厚度存在显著差异，前者较后者高出60.4%。

2.2 不同处理对野生百脉根种子萌发的影响

2.2.1 擦破种皮(Sc)处理

由图1可知，擦破种皮后，百脉根种子的发芽率提高到68%以上，平均发芽天数明显缩短，与对照之间存在显著差异(plt;0.05)。另外，29 ℃/25 ℃变温处理的发芽率显著高于25 ℃恒温(plt;0.05)，不过平均发芽天数变化不明显。

注：Student-Newman-Keuls开展多重比较，相同小写字母表示处理间发芽率差异显著; 相同大写字母表示处理间平均发芽天数差异显著(plt;0.05)。下同。图1 擦破种皮(Sc)对百脉根种子发芽率、平均发芽天数的影响

2.2.2 强酸、强碱处理

由表1可知，98%浓H2SO4和40% NaOH处理对种子萌发的影响不一致。40% NaOH浸泡百脉根种子10～30 min后，与对照相比，发芽率、平均发芽天数没有明显变化。相反，98%的浓硫酸处理种子5，15，25 min均显著地提高了种子的发芽率，缩短了平均发芽天数，其中浸泡15 min和25 min对发芽率的影响好于5 min。相比而言，浓度为49% H2SO4处理对种子发芽率没有明显影响，尽管平均发芽天数较对照缩短。

表1 不同浓度的H2SO4、NaOH对百脉根种子萌发的影响

处理发芽率(%)平均发芽天数(d)H2SO449%×5min9．0±3．2c3．2±0．6AB49%×15min10．3±2．3c3．0±0．1AB49%×25min9．7±0．9c3．4±0．1AB98%×5min38．7±2．3b2．4±0．1B98%×15min72．7±1．8a2．7±0．1AB98%×25min74．7±0．7a2．6±0．4ABNaOH40%×10min8．0±0．6a2．0±0．2A40%×20min8．0±0．6a3．0±0．2A40%×30min6±1．5a2．1±0．6A对照8．7±0．9a3．9±0．3A

2.2.3 低温沉积、低温和超低温冷冻处理

与对照相比，-4，-20 ℃低温冷冻和液氮超低温冷冻5，10，15，20 min显著地提高了种子发芽率(plt;0.05)(图2)，各个处理之间差异不显著。就平均发芽天数而言，液氮超低温冷冻处理均延长了发芽天数，其中冷冻20 min最为明显。

图2 低温和超低温冷冻处理对百脉根种子发芽率、平均发芽天数的影响

2.2.4 赤霉素及其复合胁迫对种子萌发的影响

由表2可见，种子在GA3的处理下，发芽率、平均发芽天数与对照相比有显著差异(plt;0.05)，能显著缩短平均发芽天数，说明GA3能一定程度的促进野生百脉根种子的萌发，提高种子的发芽力。但随着处理浓度的增加，发芽率、平均发芽天数无显著变化。

4 ℃干沉积和湿沉积处理对发芽率没有显著影响。不过，湿沉积后，再进行GA3处理，发芽率和平均发芽天数均发生了变化，其中发芽率得到了明显提高(plt;0.05)。另外，与擦破种皮相比，3种浓度的GA3浸泡并没有进一步提高种子发芽率或缩短发芽天数(表3)。

表2 干沉积、湿沉积、GA3及其复合处理对百脉根种子萌发的影响

处理发芽率(%)平均发牙天数(d)干沉积12．7±1．8a4．2±0．8b湿沉积8．0±2．0a3．8±0．8abGA350mg/L×湿沉积46．7±5．3b2．6±0．2aGA3100mg/L×湿沉积50．7±3．7b2．6±0．3aGA3200mg/L×湿沉积49．3±0．7b2．4±0．1a对照18．0±1．2a3．5±0．1ab擦破种皮85．0±1a3．1±0．2bcGA350mg/L×擦破种皮87．3±1．8a3．9±0．3cdGA3100mg/L×擦破种皮81．7±1．7a3．7±0．1abGA3200mg/L×擦破种皮76．7±5．0a3．2±0．1bcGA350mg/L23．3±0．7a2．1±0．1bGA3100mg/L24．3±2．0a2．0±0．2bGA3200mg/L24．0±1．5a2．2±0．3b对照8．7±0．9b3．9±0．3a

2.2.5 温水浸泡对种子萌发的影响

由表3可见，种子在40，80 ℃浸种处理下，种子发芽率并没随着处理时间的延长而增加，相比而言，当浸种时间超过60 min以后，平均发芽天数较对照明显缩短,说明野生百脉根种子经40℃浸种长时间的处理后能缩短其发芽天数。

表3 温水浸种对种子萌发的影响

处理发芽率(%)平均发牙天数(d)40℃浸种3min9．7±2．0a3．7±0．4a5min8．7±0．9a3．2±0．5a10min8．7±3．8a3．0±0．5a60min9．7±1．5a2．4±0．2b120min5．7±1．2a2．2±0．1b180min7．3±1．3a2．6±0．3b80℃浸种3min12．0±2．6a4．6±0．1a5min14．3±1．8a5．0±0．3a10min10．3±2．0a4．7±0．3a对照8．7±0．9a3．9±0．3a

3 讨论与结论

据Baskin等报道，70%以上高山植物的种子具有休眠特性[8]。本研究发现，来自青藏高原东缘的野生百脉根种子硬实率高达92.3%，只有少量的种子能吸胀，休眠程度高。与休眠性低的百脉根种子相比，野生百脉根种子的种皮厚度增加了60%，因此，百脉根种子的休眠与种皮厚度有一定关系。豆科植物硬实率高的原因与种子在成熟过程中的干燥有关[9]。硬实率高导致种子吸水困难，使得种子处于休眠之中，从而有利于度过不良的环境。但是，对于种子在农业生产中的利用与开发是不利的。

热水浸种可以软化种皮, 去掉种皮表层的蜡质和油脂, 提高透性和浸出种子内发芽抑制物[10]，然而，试验中热水浸种对野生百脉根种子萌发的影响与其它植物不一致，说明热水浸种去除野生百脉根种子硬实的效果不好。氢氧化钠具有强烈的腐蚀性，可以增加种皮的通透性，解除种子休眠。然而，试验中40%氢氧化钠浸泡10～30 min效果不明显，可见野生百脉根种皮较坚硬。因而，要打破野生百脉根种子的休眠特性，需要采用一些物理方法，或使用腐蚀性更强的药品，才能改变种皮的透性。研究结果表明，擦破种皮、98%的浓硫酸处理、-4，-20 ℃及液氮超低温冷冻种子都是不错的方法，种子发芽率得到了显著提高。其中98%的浓硫酸浸泡15 min和25 min对发芽率的影响好于5 min。相比而言，49% H2SO4处理对种子发芽率均没有明显影响。当然，98% H2SO4处理效果好于擦破种皮，因为擦破种皮过程中很容易造成胚结构的损伤，影响种子萌发。

赤霉素是提高种子发芽率的一种简单易行方法，该方法可以抑制脱落酸的活性物质, 从而有利于种子的吸水萌发[11]。在本实验中，野生百脉根种子经GA3处理后，发芽率得到了一定的提高，但处理效果不如其他处理，因此，生产中可以推广擦破种皮，低温冷冻或利用98%的浓硫酸处理15 min。限于实验条件没有进一步分析脱落酸含量的变化，下一步可以开展类似的研究。

综上所述，种皮厚、透水性差是野生百脉根种子休眠的主要原因，擦破种皮和98%的浓硫酸处理，-4，-20 ℃、液氮超低温冷冻及变温处理能有效地打破种子休眠，促进种子萌发。

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Study on Seed Dormancy and Germination Characteristics of Birdsfoot Trefoil from Qinghai-Tibetan Plateau

RENJian1,DAIWeiran1,SONGLimei1,OUYANGQing2,MAXiangli1
(1.Department of Grassland Sciences,Yunnan Agriculture University,Kuming 650201，China;2.Yunnan Academy of Grassland and Animal Science,Kunming 650220，China)

Birdsfoot trefoil (LotuscorniculatusL.) is a nutritional legume species.It adapts to slightly acidic,droughty,infertile or wet soils and widely distributes in China.However,seed dormancy results in poor subsequent stand establishment.Seeds were collected from sub-alpine meadow of Qinghai-Tibetan plateau.The objective of this study was to break dormancy by treating seeds with scarification,chemical soaking and gibberellic acid (GA3) immersion as well as freezing.Results indicated average hard seed rate of Birdsfoot trefoil was up to 92.3% and coat thickness of dormant seeds was (65.63±2.26)μm,which was 60.4 percent larger than control.Mechanical scarification significantly removed seed dormancy,and the final germination percentage (FGP) was increased from 8.7 % to 85 %.Chemical scarification treated by concentrated sulphuric acid (98% H2SO4) of 5,15,25 min was also effective in reducing hard seed and improving seed germination.Moreover,15 and 25 min-soaking were better compared with control.However,no significant effects were observed between 40% NaOH treatment and control.In addition,the higher germination rate was achieved by use of gibberellic acid or combination of cold-wet storage and GA3,-4 ℃，-20 ℃and Ultra-low temperature freezing.

LotuscorniculatusL.； dormancy; hardness seed； germination rate；mean germination time

2016-08-19

公益行业专项“青藏高原社区天然草地保护与合理利用技术研究与示范”(编号：201203006);“十二五”国家科技支撑计划项目子课题(编号：2011 BAD 17 B 02)。

任 健(1971—)，男，四川彭山人；博士，副教授，主要从事草地生态的教学和科研工作；E-mail:renjian172@126.com。

代微然(1974—)，女，实验师，主要从事牧草种质资源的研究；E-mail:iced_d@ynau.edu.cn。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.02.001

S 812.8

A

1001-4705(2017)02-0001-04