， ， ， ， ， ， ， (.贵州省旱粮研究所， 贵阳550006； .贵州大学生命科学院， 贵阳 55005；.贵州大学农学院麦作研究中心， 贵阳 55005； .贵州省植保研究所， 贵阳 550006)

蓝粒小麦育种衍生材料染色体的C带检测

隋建枢1，姚跃坤2，胡梅3，张素勤3，辛智海2，王伟1，陈天青1，何庆才4
(1.贵州省旱粮研究所， 贵阳550006； 2.贵州大学生命科学院， 贵阳 550025；3.贵州大学农学院麦作研究中心， 贵阳 550025； 4.贵州省植保研究所， 贵阳 550006)

本研究应用改良的C-带技术，对供试蓝粒小麦衍生后代11个株系共94个单株进行了分析检测，结果表明：94个单株中有25个单株检测到了长穗偃麦草的4 Ag染色体，导入率为26.60%。本研究结果可为蓝粒小麦育种后代的选育提供理论参考。

蓝粒小麦； 衍生材料； C-带

蓝粒小麦是1976年从长穗偃麦草(AgropyronelongatumL，10x=70)与普通小麦(Triticumaestivum，6x=42)复合杂交后代中选育出来的。李振声研究证明，蓝粒小麦籽粒的蓝色色素存在于胚乳细胞的糊粉层中，蓝粒小麦的形成是由于含有控制蓝色色素生物合成基因的1对长穗偃麦草染色体取代了1对小麦染色体从而进入到普通小麦中[1]；穆素梅等进一步研究证明，长穗偃麦草的4 E染色体携有蓝色糊粉层基因，是由1对长穗偃麦草染色体4 Ag代换了小麦染色体4 D所形成的[2]。Li Z S等经过连锁遗传分析发现，粗杆、宽叶、直叶、深绿色及半冬性等许多农艺性状与蓝色胚乳性状密切相关，且随着含有蓝色胚乳基因染色体数量的不同而呈现出相应的剂量效应[3]。

植物染色体的C-带技术始于Pardue和Gall观察到将小鼠染色体与随体DNA进行原位杂交后，经Giemsa染色，着丝粒区染色很深[4]。Arrighi和徐道觉在此基础上建立了C-带技术[5]。最早将C带技术应用于小麦染色体鉴定开始于1974年，经历了40多年的发展，这项技术在小麦染色体鉴定中获得了越来越多学者的认可，并在小麦育种中得到了较为广泛的应用[6]。赵燕丽等[7]用改良的Giemsa C-带技术对10个经辐射处理的带有黑麦某些性状的普通小麦品系进行鉴定，结果鉴定出1个小麦-黑麦易位系及2个小麦-黑麦异代换系。亓增军等[8]为改进小麦-黑麦1 RS·1 BL易位系的抗病性，利用染色体C-带技术从1 RS·1 BL与6 VS·6 AL易位系杂交后代F2中，鉴定出小麦-黑麦-簇毛麦双重易位纯合体1 RS·1 BL,6 VS·6 AL(2n=42)。

本研究利用染色体C-分带技术，对长穗偃麦草和普通小麦远缘杂交稳定后代株系进行染色体带型分析，以明确控制蓝色色素合成的基因，即4 Ag染色体是否成功导入。结果可为该优良种质在小麦遗传育种中的合理应用及深入研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 材 料

本研究所用的材料为蓝粒小麦(普通小麦(TriticumaestivumL.，6x=42)×长穗偃麦草(AgropyronelongatumL.，10x=70))衍生后代的种子，11个株系共94个单株，由贵州省农科院旱粮研究所引进并重组获得。

1.2 方 法

本研究采用的酶解滴片法参照Gill等[9]的方法改良C-带技术。

1.2.1 酶解滴片

1) 前期处理：选取籽粒饱满的种子放在洁净的培养皿中，置于25 ℃恒温箱中发芽，待胚根长到3～4 cm时，剪取胚根，放入管盖打孔且喷有ddH2O的离心管中，将离心管放入笑气罐中处理2 h后，将胚根取出用滤纸吸干表面水分后，置于90%乙酸溶液中固定5 min，取出胚根用滤纸吸干表面水分后，再用蒸馏水洗涤2～3次。

2) 酶解：用刀片切取1～2 mm根尖放入装有纤维素果胶酶的离心管中，离心20 s后放入37 ℃恒温水浴锅中水浴50 min，将酶解好的根尖用70%乙醇溶液反复清洗2次，离心管留约1/4乙醇，针尖捣碎，直至无悬浮颗粒。

3)滴片：将捣碎的溶液2 000 r/min离心15 s，弃上清，晾干，再加入30μL无水乙酸，用移液枪轻轻吹打。吸取8μL液体滴于载玻片上(载玻片放于25 ℃保湿盒中备用)，放于保湿盒中保湿约5 min后取出，显微镜下观察，记录，将符合要求的载玻片置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 C-带分析

将载玻片置于交联仪中1.25 MHz交联2次，放入60 ℃的0.2 mmol/L HCl中处理1.5 min，用dH2O洗净吹干；转移至饱和Ba(OH)2溶液中，室温处理6.5 min，再用dH2O洗净吹干，置于60 ℃的2×SSC溶液中处理60 min；最后将载玻片转移到pH=6.8的2.5% Giemsa染液中，染色至符合试验要求，用dH2O洗净吹干。将载玻片置于OLMPUS BX 60显微镜下观察，用Cellsens Standard摄像系统记录分裂相好的细胞[10]。

C-带染色体区分参考P.P.Jauhar[11]的长穗偃麦草小麦4 Ag染色体C-带带型。

图1 长穗偃麦草4 Ag染色体C-带标准带型

表1 供试蓝粒小麦衍生材料染色体C-带检测结果

株系名称供试单株数量含有4Ag单株数量导入率(%) 黔09197F694 黔09203F683 黔09206F610 黔9504/0147F661 黔0147/MY2002F671 黔0147/05中27F620 B⁃6228 B⁃11208 B⁃37111 B⁃35530 B⁃44250 总计942526．60

2 结果与分析

本研究所检测的是代换了普通小麦4 D染色体的长穗偃麦草4 Ag染色体，图1为其标准带型。从图1可以看出，含有4条带，分别为2条端带(T)，1条着丝点带(C)和1条中间带(I)。

图2 供试蓝粒小麦衍生材料染色体C-带带型

通过对50个根尖细胞染色体的观察发现，蓝粒小麦衍生材料的染色体数目为2x=6n=42。与标准带型作对比，可以看到，图2(A)中箭头所标注的就是代换的长穗偃麦草4 Ag染色体，而图2(B)中没有找到与之相符的染色体。供试材料中，有11个株系，共94个单株，其中有25个单株检测到了长穗偃麦草的4 Ag染色体，导入率为26.60%(表1)。

3 讨 论

通过染色体C-带技术，在供试的94个单株中，25个单株检测到了长穗偃麦草的4 Ag染色体，为蓝粒小麦育种后代的筛选提供了参考，也为蓝粒小麦育种材料的深入研究奠定了一定的理论基础。目前由于绝大多数异代换系的外源染色体补偿能力差或带有不良基因等诸多不足，使其在小麦生产中的应用受到了限制。为了提高异代换系的利用价值，选育异代换系的受体材料应选用遗传基础丰富、综合性状优良的小麦品种[12]。此外，通过建立更为经济、高效鉴定异代换系的技术规范，可以大大提高异代换系选育效率。

由于蓝色籽粒小麦属异代换系，育种世代常单体、缺体出现的频率较高，且早代单体与二体代换系的粒色很难区分，选择时二体代换系极容易丢失，要选育出一个综合性状好与稳定二体代换系非常不容易，花费的时间太长，对加快蓝粒小麦的应用非常不利。染色体的C-带技术，由于它快速、精确及经济的特点，是一种被普遍采用的鉴定外源染色体附加系、代换系或易位系的有效方法[7]。C-带技术也有自身的局限性，虽然本研究采用的改良C-带技术大大缩短了制片时间，但是仍没有克服分带的稳定性、重现性和制片成功率都很低的缺点。因此，对于带纹特征不明显的染色体，还需结合荧光原位杂交等其它技术方法进一步研究鉴定。

随着染色体分带、原位杂交和分子标记等检测技术的发展，更多、更好、更准确的分析手段，将运用到作物育种中，改变传统育种方式，使人们从中受益。

[1]李振声.小麦远缘杂交[M].北京:科学出版社,1985.

[2]穆素梅,李振声,周汉平,等.蓝粒小麦的细胞学鉴定[J].遗传学报,1986,3(4):259-261.

[3]Li Z S,Mu S M,Jiang L X,et al.cytogenetic study of blue-grained wheat[J].Zeitschrift fur Pflanzenzuchtung=Journal of plant breeding,1983,90:265-272.

[4]Pardue M L,Gall J G.Chromosomal localization of mouse satellite DNA.[J].Science,1970,168(3 937):1 356-1 358.

[5]Arrighi F E,Hsu T C.Localization of heterochromatin in human chromosomes.[J].Cytogenetics,1971,10(2):81-6.

[6]温海霞,陶澜,戴秀梅.植物染色C-显带技术及其在小麦育种中的应用研究进展[J].种子,2002,21(6):40-42.

[7]赵燕丽,王占斌,李集临,等.染色体C-带在小麦-黑麦易位系和代换系鉴定中的作用[J].植物研究,2006,26(3):333-336.

[8]亓增军,刘大钧.利用染色体C-分带和双色荧光原位杂交技术鉴定普通小麦-黑麦-簇毛麦双重易位系1 RS·1 BL，6 VS·6 AL[J].Journal of Genetics s amp; s genomics,2001,28(3):267-273.

[9]B.S.Gill,B.Friebe,T.R.Endo.Standard karyotype and nomenclature system for description of chromosome bands.Genome,1991,34:830-839.

[10]胡梅,安洪周,李鹏飞,等.提莫菲维小麦染色体的C-带分析[J].种子,2015,34(1):1-5.

[11]P.P.Jauhar.Multidisciplinary approach to genome analysis in the diploid species,ThinopyrumbessarabicumandTh.Elongatum(Lophopyrumelongatum),of the Triticeae[J].Theor Appl Genet,1990,80:523-536.

[12]李萍,王黎明,李本,等.小麦异代换系的选育及其应用研究进展[J].Journal of Anhui Agriculturalences,2007,35(13):3 824-3 825.

Detecting the Chromosomes of Blue Grained Wheat Breeding Lines with C-banding

SUIJianshu1,YAOYuekun2,HUMei3,ZHANGSuqin3，XINZhihai2,WANGWei1,CHENTianqing1,HEQingcai4
(1.Guizhou Institute of Upland Crops,Guiyang 550006,China;2.College of Life Science,Guizhou University,Guiyang 550025,China;3.Institute of Triticeae Crops,Guizhou University,Guiyang 550025,China；4.Guizhou Institute of Plant Protection,Guiyang 550006,China)

In this study,the blue wheat derived materials of 11 lines (94 individual plants) were analyzed by using the improvement of C-banding.The results showed that the 25 individuals in 94 plants were detected with Elytrigia elongata 4 Ag Chromosome.The import rate was 26.60%.The results of this study can provide a theoretical reference for the breeding of blue grain wheat.

Blue-grained wheat; breeding lines; C-banding

2016-10-19

贵州省科技计划“蓝色籽粒小麦育种素材创新与新品种选育研究”(黔科合NY[2013]3012号)；贵州省农科院人才启动项目“小麦蓝粒基因库基础群体的构建研究”[黔农科合(人才)08025号]；贵州省农业科学院重点项目“蓝粒小麦丰产群体与抗条锈病群体的组建研究”(黔农科合(重点)08003号)；国家小麦产业技术体系贵阳综合试验站(CARS-3-2-43)。

隋建枢(1986—)，男，助理研究员，主要从事小麦分子遗传育种研究；E-mail:suijianshu@126.com。

何庆才(1963—)，男，研究员，主要从事小麦遗传育种研究；E-mail:gznkykqc@yeah.net。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.02.038

S 512.1

A

1001-4705(2017)02-0038-03