魏永涛，林娣，曹广生

(1.济南市食品药品检验检测中心，济南 250101； 2.山东福瑞达生物工程有限公司，济南 250101)

柱后衍生HPLC法测定功能饮料中的牛磺酸

魏永涛1，林娣2，曹广生1

(1.济南市食品药品检验检测中心，济南 250101； 2.山东福瑞达生物工程有限公司，济南 250101)

建立柱后衍生-高效液相色谱法测定功能性饮料中牛磺酸的含量。功能性饮料中的牛磺酸经水溶提取后与邻苯二甲醛柱后衍生，以柠檬酸三钠溶液(pH 3.2)为流动相，用AMINO-NA色谱柱分离，荧光检测器检测，激发波长为338 nm，发射波长为425 nm，柱后衍生反应温度为55℃，流量为0.4 mL／min。牛磺酸质量浓度在5.0～25.0 μg／mL范围内与色谱峰面积线性关系良好，r=0.999 8，检出限(S／N=3)为0.11 μg／mL，测定结果的相对标准偏差为0.73%(n=6)，加标回收率在99.2%～101.6%之间。该方法灵敏度高、选择性好，可用于市售功能性饮料中牛磺酸的测定。

牛磺酸；功能饮料；邻苯二甲醛；高效液相色谱法；柱后衍生

牛磺酸又称2-氨基乙磺酸，是一种含硫的β氨基酸，在体内多以游离方式存在，具有多种药理和营养保健作用，被广泛应用于保健食品、医药和食品添加剂等领域。我国于1993年批准在乳制品、婴幼儿食品、谷类制品及强化饮料中可添加牛磺酸作为功能营养剂［1-5］。功能性饮品中适当添加牛磺酸，可达到强化补给及保健功效。但过量摄入牛磺酸会抑制体内其它营养元素的吸收，造成人体内营养失衡［5］，因此严格控制牛磺酸摄入量及准确检测功能性饮品中牛磺酸的含量，对均衡营养摄入具有重要意义。

目前关于牛磺酸的检测方法有滴定法［6-7］、薄层色谱法［8-9］、氨基酸自动分析法［10-13］和高效液相色谱法［14-16］等。滴定法和薄层色谱法具有经济、操作简便等优点，但易受其它杂质干扰，灵敏度不高；氨基酸自动分析法灵敏度高，选择性好，却分析耗时较长，仪器昂贵且较难普及；高效液相色谱法因具有样品预处理简单，检测快速等优点而被广泛应用［17-19］。采用柱前衍生高效液相色谱法［20-23］时，牛磺酸衍生物的稳定时间较短，衍生时间和进样时间对检测结果具有较大的影响。随着氨基酸分析柱的日益成熟和性能的不断改善，邻苯二甲醛（OPA）柱后衍生HPLC法已成为分析食品中氨基酸含量的主要手段。笔者采用AMINO-NA柱分离牛磺酸，建立了OPA柱后在线衍生HPLC法测定功能性饮料中牛磺酸的方法。样品处理后，在氨基酸专用分析柱中分离被测物，再与OPA柱后在线衍生，由FLD检测定量。将该法用于市售功能性饮料中牛磺酸含量的测定，取得了良好的效果。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：1260型，配备FLD检测器，美国安捷伦公司；

柱后衍生装置：PCR3型，美国兰博公司；高速冷冻离心机：CF16RXⅡ，日本日立公司；电子分析天平：MS105DU型，美国梅特勒-托利多公司；

甲醇：色谱纯，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；

2-巯基乙醇：色谱纯，北京百灵威科技有限公司；

邻苯二甲醛、聚氧乙烯月桂酸醚、硼酸、氢氧化钾、柠檬酸三钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

牛磺酸对照品：纯度为100%，上海安谱实验科技股份有限公司；

硼酸钾溶液：0.5 mol／L，称取 30.9 g硼酸和26.3 g氢氧化钾，用水溶解并定容至1 000 mL；

柠檬酸三钠溶液：称取19.6 g柠檬酸三钠，加入950 mL水溶解，加入1 mL苯酚，用硝酸调节pH值至3.2，经0.45μm微孔滤膜过滤［24］；

实验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

色谱柱：AMINO-NA柱(100 mm ×6.0 mm，日本岛津公司)；流动相：柠檬酸三钠溶液，流量为0.4 mL／min；荧光衍生溶液流量：0.4 mL／min；色谱柱及柱后衍生装置PCR3温度：55℃；检测器：荧光检测器，激发波长为338 nm，发射波长为425 nm；进样体积：20 μL；外标法定量。

1.3 溶液制备

1.3.1 衍生化溶液

称取0.6 g邻苯二甲醛，用10 mL甲醇溶解，加入0.5 mL 2-巯基乙醇、0.35 g聚氧乙烯月桂酸醚，用硼酸钾溶液定容至1 000 mL，经0.45 μm滤膜过滤后使用，临用前现配且避光操作。

1.3.2 对照品溶液

精密称取牛磺酸对照品25.80 mg，用水稀释并定容至25 mL，得牛磺酸标准储备溶液。精密量取牛磺酸标准储备溶液5.0 mL于100 mL容量瓶中，加水至标线，摇匀即得牛磺酸标准溶液。分别移取牛磺酸标准溶液 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，置于 5 个10 mL容量瓶中，配制成质量浓度分别为5.0，10.0，15.0，20.0，25.0 μg／mL 的系列标准工作溶液。

1.3.3 样品溶液

精密称取混匀样品约2.0 g于100 mL容量瓶中，加入50 mL水，超声提取15 min，待冷却至室温，用水定容至标线并摇匀，以5 000 r／min离心10 min，取上清液经0.45μm滤膜过滤，取续滤液，再经0.22μm滤膜过滤，待测。

2 结果与讨论

2.1 样品溶液制备时稀释液的选择

对样品溶液制备时所需稀释液进行试验考察，在红牛、乐虎、东鹏特饮3种功能饮料样品中分别加水稀释［16，25-26］或加入偏磷酸 (去除蛋白 )稀释［20］，超声提取15 min，冷却至室温，然后加入水稀释并定容至100 mL，取样进行测定。结果表明，加入偏磷酸和直接加水稀释，其测定结果无显著性差异，因此选择超纯水作为稀释液。

2.2 流动相的选择

AMINO-NA柱为强酸阳离子交换色谱柱，当流动相pH为3.10～3.25时，强酸性阳离子交换剂具有较高的交换容量(全部离子化)。对于流动相pH的控制，阳离子交换剂常选用柠檬酸根离子的缓冲液；同时在离子交换色谱中，又常用硝酸钠控制流动相的离子强度［27］。因此选择柠檬酸三钠作为流动相［24］。

2.3 衍生剂流量与衍生反应温度的选择

影响衍生化效果的主要因素是衍生剂的流量和衍生反应温度［24］。根据色谱柱厂商推荐的条件(流量为 0.3～0.8 mL／min，柱温不高于 95℃ )，固定色谱柱流量为0.4 mL／min，柱温为55℃，考察衍生剂流量为 0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL／min 时衍生物色谱峰面积的变化情况。结果发现，衍生流量为0.4 mL／min时，其它杂质的干扰最小，衍生物的响应值最高，因此衍生剂流量选择为0.4 mL／min。固定衍生流量为0.4 mL／min和其它色谱条件，考察衍生温度为45～75℃时，衍生物色谱峰面积的变化情况。结果发现，衍生温度为55℃时，衍生物的响应值最佳，因此选择衍生反应温度为55℃。

2.4 激发波长和发射波长的选择

在2-巯基乙醇作用下，牛磺酸与OPA缩合反应产生蓝色荧光，该缩合物最大激发波长在335～340 nm 之间［28-29］，试验选择以 338 nm 作为固定激发波长。设置发射波长分别为415，425，435，445，455，465 nm，结果发现发射波长为425 nm时，其它物质在激发波长338 nm处无荧光发射或发射的荧光强度最弱，干扰最小，因此选择发射波长为425 nm。

2.5 色谱分离

在1.2仪器工作条件下，对牛磺酸对照品溶液及供试品溶液进行测定，色谱图分别见图1、图2。由图1、图2可知，使用AMINO-NA柱能很好地分离饮料中的游离牛磺酸，使用荧光检测器定量检测衍生物，减少了其它物质的干扰，提高了检测灵敏度。

图2 牛磺酸供试品溶液色谱图

2.6 工作曲线方程与检出限

在1.2仪器工作条件下，对1.3.2中系列标准工作溶液进行测定，以牛磺酸质量浓度(X，μg／mL)为横坐标，以色谱峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，得线性方程为Y=131.1X+26.7，r=0.999 8，线性范围为 5.0～25.0 μg／mL。

以3倍信噪比(S／N=3)对应的牛磺酸质量浓度作为方法检出限，经计算得方法的检出限(LOD)为 0.11 μg／mL。

2.7 精密度试验

移取质量浓度为2.5 μg／mL的牛磺酸标准工作溶液重复进样测定，记录色谱峰面积并计算测定结果的相对标准偏差，结果见表2。由表2可知，牛磺酸标准工作溶液测定结果的相对标准偏差为0.73%，表明方法的精密度较高。

表2 精密度试验结果(n=6)

2.8 加标回收试验

按实验方法对红牛饮料样品进行测定，然后进行低、中、高浓度的加标回收试验，试验结果见表3。由表3可知，方法的加标回收率在99.2%～101.6%之间，其相对标准偏差为0.12%～0.20%，表明所建方法准确度良好。

表3 加标回收试验结果(n=4)

2.9 样品测定

用所建立的方法对市售红牛品牌6个不同批次的饮料样品进行测定，结果见表4。

表4 样品测定结果(n=4)

由表4可知，方法测定结果的平均值与标示值接近，相对标准偏差为0.10%～0.20%，说明本方法具有较高的准确度和精密度，可用于功能性饮料中牛磺酸的检测。

3 结语

采用AMINO-NA柱分离功能性饮料中的牛磺酸，与邻苯二甲醛(OPA)柱后在线衍生，衍生物由荧光检测器定量检测，该方法简化了实验操作步骤，提高了检测灵敏度，测定结果准确可靠，适用于市售功能性饮料中牛磺酸的检测。

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中国仪器仪表行业协会七届五次理事（扩大）会议在郑州隆重召开

中国仪器仪表行业协会第七届五次理事(扩大)会议不久前在郑州隆重召开，来自协会理事单位和会员企业的200余位代表参加了会议，专职副理事长兼秘书长李跃光、副理事长高玉清、曾艳丽、郭峻峰、宣瑞国、任红军、欧阳劲松、王学信、刘龙官、陈吉文、钟琼华、张明远、庄庆伟、李源等领导出席。

会议由副理事长高玉清主持。理事会的主要议程有两项：第一项是听取协会2017年的工作情况汇报，第二项是审议吸收新会员、副理事长变更、增补理事和聘任副秘书长的议案。

会议首先听取了中国仪器仪表行业协会专职副理事长兼秘书长李跃光同志关于2017年协会工作情况汇报。报告就一年来协会的工作做了认真总结，今年协会主要工作是适应新形势下企业会员的需要，同时对协会下一步的工作提出了很好的设想。各会员单位、各理事、各副理事长单位积极响应，计划通过大家共同的努力把协会的自身建设和协会工作做得更好。

会议审议通过了关于吸收新会员、副理事长变更、增补理事和聘任副秘书长的议案。

为了给各位会员企业提供更好更多的行业信息，加强企业之间交流和行业情况沟通，今年特意在召开理事扩大会议的同期，安排举办仪器仪表行业发展峰会。会后，协会组织参会代表考察了新乡市平原示范区，考察项目包括华兰生物医药产业园、电子信息产业园等。

(仪器信息网)

Determination of Taurine in Functional Drinks by HPLC with Post-column Derivatization

Wei Yongtao1， Lin Di2， Cao Guangsheng1
(1. Jinan City Institute for Food and Drug Control， Jinan 250101， China ；2. Shandong Freda Bio-engineering Co.， Ltd.， Jinan 250101， China)

A method for detecting taurine in functional drinks by HPLC with post-column derivatization was established. Taurine in functional drinks was extracted after being dissolved in water，and derivatized with ortho-phthalaldehyde post-column. Sodium citrate solution (pH3.2) was used as mobile phase，and an AMINONA column was applied for separation. The excitation wavelength of fluorescence detector was set at 338 nm and emission wavelength at 425 nm. The temperature for derivatization reaction was 55℃，and the flow rate was 0.4 mL／min. The mass concentration of taurine was linear with chromatographic area in the range of 5.0-25.0 μg／mL,r=0.999 8. The detection limit(S／N=3) was 0.11 μg／mL, the relative standard deviation of detection results was 0.73%(n=6). The spiked recovery was between 99.2% and 101.6%. This method has high sensitivity and selectivity，which can be used for the determination of taurine in commercially available functional drinks.

taurine; functional drink; ortho-phthalaldehyde; high performance liquid chromatography; postcolumn derivatization

O657.7 文献标识码：A 文章编号：1008-6145(2017)06-0041-04

10.3969／j.issn.1008-6145.2017.06.010

联系人：魏永涛；E-mail： xiaozi2964@163.com

2017-08-12