黄连对糖尿病脑缺血再灌注模型大鼠Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

覃小军冯爱平黄其军乔伟王文

黄连; 糖尿病; 脑缺血再灌注; Bax; Bcl-2; 细胞凋亡

缺血性脑卒中是糖尿病的严重并发症之一,糖尿病性脑缺血占缺血性脑卒中的20%～25%,且缺血面积大、症状重、预后更差[1]。现已明确糖尿病加重脑缺血再灌注损伤是一个多因素、多机制、多环节的恶性级联过程,其中细胞凋亡在糖尿病加重缺血性脑损伤的过程中起重要作用。当脑缺血发生后,若错过溶栓或取栓时间窗,则无确切有效的治疗手段,故糖尿病合并脑缺血的治疗仍为亟待解决的难题。

经大量研究表明,黄连主要有效成分为生物碱类和酮类,具有抗菌消炎、降压降糖、抑癌防癌及抗氧化、抗凋亡、保护神经细胞等作用[2]。当脑缺血损伤发生后,机体γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸水平急剧升高,加重脑细胞损伤,而黄连中的总黄酮可以促进脑缺血模型大鼠丘脑中谷氨酸和GABA 含量恢复至正常水平,减轻细胞损伤,增强神经元对缺血的耐受性,发挥神经保护作用[3]。同时也有研究证实,黄连可增加胰岛素生物活性和胰岛素敏感性,对糖尿病大鼠醛糖还原酶活性有抑制作用,对糖尿病及其神经病变有很好的防治作用[4]。糖尿病脑缺血发生后,主要凋亡信号转导通路(Bax/Bcl-2)被激活,诱导神经细胞凋亡。有研究证实，黄连可使促凋亡成员Bax表达减弱,而抗凋亡成员Bcl-2 表达相对增强,从而降低神经细胞凋亡，保护脑缺血损伤的神经细胞[5]。

本研究采用佐链脲菌素(STZ)腹腔注射造糖尿病模型,用线栓法造大鼠脑部急性缺血损伤[6],制备大鼠脑缺血再灌注模型,观测黄连水提取混合物对糖尿病脑缺血再灌注模型大鼠Bax和Bcl-2蛋白表达情况的影响,从作用机制方面探究黄连单味药在脑缺血再灌注造成的神经损伤方面的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Sprague-Dawley雄性大鼠60只,SPF级,体质量均为180～220 g,8周龄,由广东省医学实验动物中心提供,许可证号:SCXK(粤)2008-0002。

1.2 药物与试剂 黄连购自广东省珠海市三灶镇源春林大药房(经遵义医学院珠海校区药学教研室鉴定为植物黄连的根茎); STZ粉剂(美国Sigma公司);10%水合氯醛注射液(上海宝曼生物);一抗:兔源抗鼠Bax多克隆抗体、兔源抗鼠Bcl-2多克隆抗体(上海碧云天生物);兔源抗鼠β-actin单克隆抗体(上海碧云天生物);二抗:辣根过氧化物酶标记山羊抗兔(上海碧云天生物);RIPA蛋白裂解液(上海碧云天生物);PMSF (上海碧云天生物);PVDF膜(上海碧云天生物);其余试剂均为国产分析纯。

1.3 黄连药液的制备 用天平准确称取上述鉴定过的黄连10 g,第一次煎煮时料液比为1∶10,第二次煎煮时料液比为1∶8,共煎煮2次,每次煎煮1 h,煎煮完成后合并水煎液,置于旋转蒸发仪中浓缩,制成含生药分别为100 mg/ml、50 mg/ml和25 mg/ml的药液备用。

1.4 动物分组及给药 SD雄性大鼠随机分为4组:假手术组、糖尿病合并脑缺血再灌注高、中、低剂量黄连治疗组,每组各15只。除假手术组灌胃生理盐水(10 ml/kg)以外,其余各治疗组分别灌予相应药物剂量(按含生药100 g/kg, 50 g/kg, 25 g/kg灌注) ,1次/d,连用7 d后造模。

1.5 糖尿病模型制备方法 大鼠禁食8 h以上,左下方腹腔内注射STZ 30 mg/kg,24 h后再次腹腔注STZ 35 mg/kg,正常进食饮水饲养7 d,中间不进行血糖干预,也不进行糖尿病饮食控制。密切动态观察大鼠症状和体征变化,应用罗氏血糖仪(德国罗氏公司)测定尾尖静脉血糖,当随机血糖>13.5 mmol/L且伴有多饮、多尿、体质量下降等表现者判定为糖尿病制模成功。假手术组注射等体积的无菌生理盐水。

1.6 缺血再灌注动物模型制备方法 采用改良线栓法制大脑中动脉栓塞模型:用10%水合氯醛(350 mg/kg)左下腹腔注射麻醉,颈前正中旁切口,充分暴露颈总动脉，分离颈内动脉和颈外动脉及其分支;结扎颈外动脉,特定尼龙线栓从颈总动脉插入,向颈内动脉方向进入颅内至大脑中动脉与大脑前动脉分叉处(此时感到有阻力,线栓进入颈动脉大约18 mm左右)阻断血流;固定线栓,60 min后拔除线栓,再灌注120 min后取材。假手术组插入线栓但不堵塞大脑中动脉,插入深度为8～10 mm。以SD大鼠麻醉醒后有神经功能缺损且未死亡作为动物模型制备成功为标准进行判断。神经功能缺损评分按改良Bederson评分标准执行[7]。

1.7 目的蛋白表达情况检测 采用Western blot法检测,各组大鼠再灌注2 h后,断头处死,在冰盘上(低温环境下)快速剥离脑组织(保持完整性),剔除脑干及多余脂肪,冻存备用。准确称取大鼠的海马区组织100 mg提取总蛋白,加组织裂解液0.99 ml和0.01 ml PMSF于小匀浆器中,至冰上研磨粉碎细胞30 min,4 ℃ 12 000 r/min离心10 min,收集上清液,即为海马组织蛋白,-80 ℃保存。BCA法测定提取组织的蛋白浓度,根据蛋白浓度换算所取蛋白溶液体积。取稀释过的等量蛋白加5×SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上样缓冲液按1∶4的比例混合,混匀后蛋白变性于沸水中煮沸5 min。取变性后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳,浓缩胶电压为80 V,分离胶电压为120 V,进行SDS-PAGE电泳后将含有目的条带的蛋白转移到PVDF膜上(湿转, 转膜条件220 mA, 30 min)。用(5%脱脂奶粉)封闭液(用TBST配置)封闭2 h,用TBST漂洗工作液充分漂洗(8min×2次)。经漂洗后的PVDF膜片分别滴加对应抗体(Bax多克隆抗体、Bcl-2多克隆抗体)(稀释度为1∶700),用薄膜袋密封后置于4 ℃冰箱内孵育过夜(约24 h)。孵育一抗后的PVDF膜用TBST漂洗工作液洗涤3次,每次5 min,加入酶标二抗(稀释度为1∶1000),用薄膜袋密封后置于室温摇床内孵育2 h,孵育二抗后的PVDF膜用TBST漂洗工作液洗涤3次,每次5 min,ECL法显色,胶片曝光显影定影后留底保存。用β-actin做内参蛋白重复以上步骤。采用Image J软件分析胶片图像,以Bax/β-actin,Bcl-2/β-actin比值分别表示目的蛋白的相对表达水平,采用积分光密度值(IOD)表示。

2 结果

2.1 腹腔注射STZ前后48 h血糖变化 各治疗组注射前后血糖变化见表1,黄连低剂量组与黄连高剂量组比较差异有统计学意义(P<0.05)。黄连低剂量组与黄连中剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 STZ腹腔注射前后48 h血糖变化表(,mmol/L,n=15)

注:与黄连低剂量组比较,*P<0.05

2.2 神经功能评分 缺血再灌注动物模型制作成功后2 h,所有实验大鼠均从麻醉中清醒。除假手术组,其余各组均出现不同程度的神经功能缺损。假手术组、黄连低剂量组、黄连中剂量组和黄连高剂量组神经功能评分分别为(0.00±0.0)分、(3.40±0.5)(3.20±0.41)分和(2.50±0.43)分,各组间差异有统计学意义(F=12.632,P<0.05)。与假手术组比较,不同剂量黄连干预组差异均有统计学意义(P<0.05);黄连中剂量组与低剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05);黄连高剂量组神经功能缺损较中、低剂量组显著减轻(P<0.05)。

2.3 Bax蛋白表达水平比较 假手术组大鼠的Bax蛋白表达量较黄连各剂量组低,而黄连可下调各治疗组的Bax蛋白表达(P<0.05);且随着剂量的增加,效果越来越明显(P<0.01);内参各组蛋白条带IOD差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.4 Bcl-2蛋白表达水平比较 假手术组大鼠的Bcl-2蛋白表达量较黄连各剂量组低,黄连可上调各剂量组Bcl-2蛋白表达(P<0.05);且随着剂量的增加,效果越来越明显(P<0.01);内参各组蛋白条带灰度值差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

注: 1: 高剂量组; 2: 中剂量组; 3: 低剂量组; 4: 假手术组图1 黄连对糖尿病脑缺血再灌注模型大鼠Bax、Bcl-2蛋白表达的影响(WB胶片照片)

表2 黄连对糖尿病脑缺血再灌注模型大鼠Bax和Bcl-2蛋白表达的影响(n=15)

注:与假手术组比较，*P<0.05;与黄连低剂量组比较，△P<0.05

3 讨论

目前认为糖尿病加重脑缺血再灌注损伤机理与兴奋性氨基酸毒性、钙超载、自由基反应、梗死周围除极化及细胞凋亡有着密切的关系[8]。经研究证实脑缺血损伤与细胞凋亡密切关系,其受凋亡序列基因调控[9]。细胞凋亡由多种相关的凋亡基因调控,其中Bcl-2和Bax是最早研究的凋亡相关基因,Bcl-2和Bax蛋白水平高低与凋亡调控密切相关。现认为Bcl-2和Bax是抑制和促进细胞凋亡的两个最重要基因[10-11]。本研究发现在黄连治疗组中促细胞凋亡蛋白Bax显著降低,且随黄连剂量的增加Bax蛋白的表达量显著减少。而抑制凋亡蛋白Bcl-2水平在黄连治疗组的变化趋势与Bax蛋白表达相反。同时黄连高剂量治疗组的血糖,神经功能评分均较其他各组改善显著,故黄连高剂量治疗组降低血糖,改善神经功能评分,可能与调节Bcl-2和Bax蛋白表达相关。

体外研究表明Bcl-2基因可阻止由多种刺激物诱导的细胞凋亡途径相同的凋亡,其过表达可导致细胞产生多种促凋亡耐受,因此,抑制Bcl-2基因表达可能是多种细胞凋亡的共同作用通路,其表达下调可诱导细胞凋亡[12]。

黄连提取物在一定浓度范围内明显对糖尿病大鼠脑缺血再灌注损伤引起的神经元凋亡有抑制作用,推断其可能通过阻断线粒体凋亡途径发挥抗损伤作用;黄连可能通过调节Bcl-2和Bax蛋白表达量,负调控大鼠脑缺血再灌注损伤中的神经细胞凋亡,从而起到改善脑缺血再灌注损伤的功能。在脑缺血再灌注损伤中，Bcl-2/Bax比值是一个动态平衡过程,当平衡被打破时凋亡就会加速发生发展,故在研究中观察Bcl-2/Bax的值显得尤为重要。高血糖会加重脑缺血再灌注损伤已无可争议,但其机制至今尚未完全清楚。越来越多的研究证明,凋亡是糖尿病合并缺血脑组织再灌注损伤的重要因素,其中,凋亡因子Bcl-2和Bax是构成了脑缺血再灌注损伤转变的基础。本研究证实,高剂量的黄连可以改善糖尿病合并脑缺血大鼠神经功能缺损症状和调节Bcl-2和Bax的比值,提示高剂量的黄连抗凋亡作用明显。

[1] Hafez S, Coucha M, Bruno A, et al. Hyperglycemia, acute ischemic stroke, and thrombolytic therapy[J]. Transl Stroke Res, 2014, 5(4):442-453.

[2] 马红梅, 陈刚, 李文,等. 黄连化学成分的分离与鉴定[J]. 沈阳药科大学学报, 2011,28(9):695-699.

[3] 李新崇, 阮立新, 黄其川,等. 黄连碱对脑缺血/再灌注大鼠的影响及其机制研究[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2015, 20(9):1004-1007.

[4] 赵晓莲, 隋洪玉, 李凯霞,等. 黄连素对糖尿病大鼠脑组织的保护作用[J]. 黑龙江医药科学, 2006, 29(3):4-5.

[5] 茹爱忠, 范强, 杨丽霞. 基于中国知网数据库分析黄连素治疗糖尿病的研究现状[J]. 卫生职业教育, 2017, 35(9):133-135.

[6] 陈晓娟,肖宗宇,潘琪,等.改良线栓法大鼠脑缺血再灌注损伤模型的建立[J]. 中国医学创新, 2015,12(3):24-27.

[7] Hunter A J, Hatcher J, Virley D, et al. Functional assessments in mice and rats after focal stroke.[J]. Neuropharmacology, 2000, 39(5):806-816.

[8] Maddahi A, Edvinsson L. Cerebral ischemia induces microvascular pro-inflammatory cytokine expression via the MEK/ERK pathway[J]. J Neuroinflammation, 2010, 7:14.

[9] 高红莉, 刘昭纯, 曲晓兰. 活血熄风方对局灶性脑缺血大鼠神经细胞凋亡及基因蛋白蛋白表达的影响[J]. 中国实验方剂学杂志, 2010, 16(3):74-76.

[10] Chen J, Graham SH, Nakayama M, et al. Apoptosis repressor genes Bcl-2 and Bcl-x-long are expressed in the rat brain following global ischemia[J]. J Cerebral Blood Flow Metab, 1997, 17(1):2-10.

[11] Sulejczak D, Czarkowska-Bauch J, Macias M, et al. Bcl-2 and Bax proteins are increased in neocortical but not in thalamic apoptosis following devascularizing lesion of the cerebral cortex in the rat: an immunohistochemical study[J]. Brain Res, 2004, 1006(2):133-49.

[12] 刘春岭, 刘玉府, 李昕,等. 雌激素对血管性痴呆大鼠认知功能、海马Bcl-2、Bax蛋白表达及神经元凋亡的影响[J]. 临床神经病学杂志, 2009, 22(6):433-435.

EffectofCoptidisRhizomaonexpressionofBaxandBcl-2proteinsindiabeticratsmodelofcerebralischemiareperfusion

QINXiao-jun,FENGAi-ping,HUANGQi-jun,QIAOWei,WANGWen.
DepartmentofNeurology,theSecondPeople’sHospitalofDeyangCity,Deyang618000,China

ObjectiveTo explore the effect of coptidis rhizoma on the expression of Bax and Bcl-2 proteins and to explore the protective mechanism in diabetic rats complicated with cerebral ischemia after cerebral ischemia reperfusion.MethodsSixty SD rats were selected and randomized into four groups: sham group and high, medium, low dose groups of coptidis rhizome (100 g/kg, 50 g/kg, 25 g/kg), each involved fifteen rats. The pretreatment group with STZ injection was the diabetic model, and the rats were continuously monitor for 7 days until the blood glucose was stable, and then the cerebral ischemia reperfusion model was made by suture method. The expressions of Bax and Bcl-2 proteins were detected 120 min after cerebral ischemia/reperfusion treated by coptidis rhizoma.ResultsThe expression of Bax protein in the sham group was significantly lower than that in other groups (P<0.05),the expression of Bax protein decreased significantly with the increasing dosage of coptidis rhizoma (P<0.05). The expression of Bcl-2 protein in the sham group was lower than that in other groups (P<0.05), and the expression of Bcl-2 protein increased with the increasing dosage of coptidis rhizoma (P<0.05). The pretreatment group with high dosage of coptidis rhizoma could improve the neurological deficit and blood sugar.ConclusionsCoptidis rhizoma can up regulate the expression of Bcl-2 protein and down regulate the expression of Bax protein, meanwhile reduce the neurological function score and the levels of blood sugar. Coptidis rhizoma may protect the injury induced by diabetes mellitus complicated with cerebral ischemia/reperfusion through inhibiting neuron apoptosis.

coptidis rhizome; diabetes; reperfusion injury; Bax; Bcl-2; cell apoptosis

618000 四川省德阳市，德阳市第二人民医院神经内科

目的探讨黄连对糖尿病合并脑缺血再灌注模型大鼠Bax蛋白和Bcl-2蛋白表达的影响及其保护糖尿病合并脑缺血再灌注大鼠的脑损伤作用机制。方法本实验将SD雄性大鼠60只随机分为4组,即假手术组和糖尿病脑缺血再灌注黄连高、中、低(100 g/kg, 50 g/kg, 25 g/kg)剂量组,每组15只。黄连干预组给予佐链脲菌素(STZ)注射造糖尿病模型。连续监测血糖7 d,待血糖稳定后,用线栓法造脑缺血再灌注模型。观察黄连对糖尿病大鼠脑缺血再灌注120 min后脑组织Bax蛋白和Bcl-2蛋白表达的影响。结果假手术组的Bax蛋白较其他各组低,差异有统计学意义 (P<0.05),而黄连低、中、高剂量组的Bax蛋白表达呈降低趋势(P<0.05)。假手术组的Bcl-2蛋白表达亦较其他各组低,各黄连剂量组的Bcl-2蛋白表达随黄连剂量增加而增高(P<0.05),降低血糖,可明确改善神经功能缺损症状(P<0.05)。结论高剂量黄连能下调Bax蛋白、上调Bcl-2蛋白表达,降低血糖,改善神经功能缺损症状,抑制糖尿病合并脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡,从而对糖尿病合并脑缺血再灌注损伤起到保护作用。

R 587.1; R 747.9

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2017.11.007

2017-05-21)