段庆宁

【摘要】 目的：探索Th17细胞及IL-17、IL-21在牛奶蛋白过敏（CMA）婴儿发病机制中的作用。方法：采集病例组治疗前后和健康对照组各25例患者的空腹外周静脉血，用流式细胞仪技术测定Th17细胞在CD4+T细胞中的占比，用ELISA法检测上清IL-17、IL-21水平，比较两组的各项指标。结果：病例组治疗前Th17细胞占比（8.97±2.81）%，治疗后（3.72±2.52）%，对照组（1.92±1.38）%，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。IL-17在对照组、病例组治疗前、病例组治疗后分别为（3.05±1.61）、（25.58±7.89）、（13.07±9.63）ng/mL，IL-21在对照组、病例组治疗前、病例组治疗后分别为（1.88±1.62）、（13.43±4.3）、（9.13±4.67）ng/mL，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：Th17细胞、IL-17和IL-21可能为CMA的研究及治疗提供了靶向依据。

【关键词】 牛奶蛋白过敏（CMA）； Th17细胞； IL-17； IL-21

【Abstract】 Objective：To explore the role of Th17 cells，IL-17 and IL-21 in the pathogenesis of cows milk allergy（CMA）.Method：The fasting peripheral venous blood in control group of 25 cases and before and after treatment in case group of 25 cases were collected，the percentage of Th17 cells in CD4+ T cells was measured by flow cytometry，the levels of IL-17 and IL-21 in supernatant were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA），those indicators of two groups were compared.Result：The proportion of Th17 cells was （8.97±2.81）% before treatment，（3.72±2.52）% after treatment and （1.92±1.38）% in the control group，the differences were statistically significant（P<0.05）.In the control group，the case group before treatment and after treatment IL-17 were respectively （3.05±1.61），（25.58±7.89）and （13.07±9.63）ng/mL；IL-21 were respectively （1.88±1.62），（13.43±4.3） and （9.13±4.67）ng/mL， compared of those，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Th17 cells，IL-17 and IL-21 may provide potential targets for the study and therapy of CMA.

【Key words】 Cows milk allergy（CMA）； Th17 cells； IL-17； IL-21

First-authors address：Nantong University Affiliated Taizhou Peoples Hospital，Taizhou 225300，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.28.012

牛奶蛋白過敏（Cows milk allerge，CMA）是婴儿最常见的食物过敏，在欧洲发病率2%～3%[1]。国内尚无CMA的发病率统计，但有关我国两岁以下儿童一项调查发现，食物过敏的发生率为5.5%～7.3%[2]。CMA可涉及各个系统，临床表现多样，以胃肠道及皮肤症状为主，如胃食管反流、呕吐、腹胀、腹泻、便血、便秘、湿疹、荨麻疹等，还可表现为缺铁性贫血、生长发育缓慢、喘息、慢性咳嗽等[3]。目前已发现多种免疫细胞及因子参与其中，但具体机制尚不明确。治疗方法包括疗效确切的饮食回避法和结论不一的口服益生菌法等[4]。Th17是近几年发现的Th细胞亚群，由初始T细胞在TGF-β、IL-6、IL-1β和IL-23刺激后分化而来[5]，并通过其特征性细胞因子IL-17、IL-21、IL-22发挥生物学作用。已证实Th17及其相关细胞因子广泛参与到多种炎症、风湿性疾病、变态反应性疾病中[6-10]，但尚无与CMA有关的报道。本文通过对CMA婴儿及健康婴儿外周血Th17比例，IL-17、IL-21水平的测定，探索其在CMA发病机制中的作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 参照文献[11-12]选取2016年1-10月泰州市人医院门诊就诊的疑诊为CMA的婴儿40例。所有患儿经食物回避3周，剔除不遵医嘱者4例，结果临床症状无明显改善者4例，明显改善者32例。选择症状明显改善者32例行开放性口服食物激发试验（OFC），1周内观察反应，最终确诊CMA共计25例进入病例组。选择同期本院儿童保健科健康体检婴儿25例作为对照组。病例组25例患儿就诊时主要症状以腹泻、皮疹（反复、严重的湿疹）、便血为主，另外还有少数表现腹胀、易激惹、生长发育落后、贫血等。对照组25例健康儿童中9例表现为轻度湿疹。两组患儿年龄、性别比较差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。排除标准：（1）存在先天性免疫功能异常；（2）存在先天性肠道结构异常；（3）入组前3个月及入组后存在严重感染，如败血症、脓毒血症、重症肺炎等；（4）入组前3个月及入组后使用静脉人血丙种球蛋白、口服或静脉糖皮质激素；（5）其他可能影响机体免疫功能、肠道正常功能的情况。本研究取得了泰州市人民医院伦理委员会批准，入组患儿家长均签署知情同意书。endprint

1.2 方法

1.2.1 病例组患儿干预方法 病例组CMA患儿饮食上采取营养干预为主，（1）纯母乳喂养者7例：继续鼓励母乳喂养，乳母回避牛奶及奶制品、坚果、海鲜以及其他食用后引起患儿症状反复的食物。（2）混合喂养者16例：乳母回避可疑食物，同时根据患儿病情选用不同配方奶粉。深度水解配方奶粉15例，氨基酸配方奶粉1例。（3）配方奶喂养者2例，均改为深度水解配方奶粉喂养。另外，有胃肠道症状者加用培菲康散剂或者妈咪爱口服，有严重湿疹者局部使用氢化可的松霜剂1∶1混合维生素E霜短期外用，并且坚持补充维生素D3。由本科经验丰富的2名护理人员跟踪指导CMA患儿日常护理方法，密切随访，监测生长发育情况，6个月后所有CMA患儿再次行激发试验，所有研究对象均无病例失访。

1.2.2 流式细胞仪检测Th17比例 两组患儿均采集晨空腹颈静脉血3 mL，置肝素抗凝管中，6个月后行激发试验前所有CMA患儿再次采集晨空腹颈静脉血3 mL。向新鲜肝素化外周血中加入等体积淋巴细胞分离液，离心后获得外周血单个核细胞（PBMC）悬液，以12孔板培养，加入补充10%胎牛血清的RPMI-1640、佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯、离子霉素，室温孵育4 h，前1 h内加入莫能菌素。再加入人CD4抗体，4 ℃避光孵育30 min。加入PE标记的IL-17单抗，4 ℃避光孵育20 min。离心后以PBS液洗涤2遍，以流式细胞仪（BD，美国）检测Th17比例。除PE标记的IL-17单抗购自上海研盟生物科技有限公司，余试剂及抗体均购自美国BD公司。

1.2.3 ELISA法检测血浆IL-17、IL-21水平 试剂盒购自江苏凯基生物股份有限公司，按产品说明书严格操作。

1.3 统计学处理 使用SPSS 20.0统计软件进行处理，计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验或Fishers精确概率法，流式分析数据以Th17细胞在CD4+T淋巴细胞中的百分比表示，率的比较采用 字2检验，以P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患儿Th17比例、IL-17及IL-21水平比较 病例组治疗前Th17占CD4+T淋巴细胞比例（8.97±2.81）%，治疗后占比（3.72±2.52）%，对照组占比（1.92±1.38）%，比较差异有统计学意义（P<0.05），见图1。两组患儿IL-17及IL-21水平比较差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.2 病例组患儿营养干预处理后耐受情况比较 根据疗效判定标准分为耐受者（显效和有效）22例，耐受失败者（无效）3例[13]，干预有效率达88.0%。单独分析耐受失败的3例患儿发现其三组指标治疗前后比较差异均无统计学意义（P>0.05），见表3。

3 讨论

食物过敏是婴儿常见的过敏性疾病，由多种因素、多个系统、多种机制共同参与，常分为IgE介导（速发型过敏反应）、非IgE介导（迟发型过敏反应）、IgE和非IgE混合介导三种类型。常见的过敏原包括牛奶、鸡蛋白、见过、贝壳类、海鲜等，牛奶蛋白过敏是常见的食物过敏，可能与肠道黏膜屏障破坏、肠道通透性增加、口服不耐受等有关[14]。以胃腸道为主要表现的牛奶过敏通常是非IgE介导和混合介导型。牛奶蛋白性直肠炎是最常见的CMA性消化道疾病，主要表现为腹泻及血便，诊断的金标准是牛奶蛋白激发试验[15]。

CMA治疗的关键是牛奶蛋白回避，并进行饮食替代，目前治疗CMA的配方奶主要有豆奶粉、部分及深度水解配方奶粉、游离氨基酸配方奶粉。使用替代治疗干预后，患儿临床症状、实验室指标可有明显改善，孙灿等[16]发现干预治疗后6个月患儿的总有效率可达到97.6%。本研究结果有效率88.0%，也说明了饮食替代治疗的有效性。豆奶粉生物利用度低，长期使用可引起生长发育不良，故不被大多营养学会推荐。国内学者研究发现，游离氨基酸配方奶粉在治疗效果方面优于水解配方奶粉，建议有条件的家庭建议使用游离氨基酸配方奶粉[17-18]。但对CMA患儿来说，由于治疗过程中奶制品、母乳的剥离，会有较多心理及生理的远期影响。有研究发现，CMA儿童到了学龄期，会有严重而频繁的精神障碍[19]，且CMA与哮喘、过敏性鼻炎等变应性疾病关系密切。所以探索CMA发病机制，找出有效的治疗方法显得尤为重要。

谢广清等[20]对IgE及非IgE介导的CMA患儿行胃镜检查发现，他们的胃黏膜病理均呈慢性炎症性改变，伴部分病例的中性粒细胞浸润，提示炎症反应在CMA中的普遍存在。Th17活化是促进炎症性疾病发生发展的重要因素，主要介导中性粒细胞性炎症反应[21]。本研究中，病例组Th17在CD4+T细胞中的占比明显高于对照组，且治疗前后Th17比例也有明显改变，支持了上述观点。

IL-17是Th17代表性细胞因子，在哮喘的研究中发现其通过诱导气道上皮细胞和平滑肌细胞分泌TNF-α、IL-6等炎性介质，促进中性粒细胞成熟和活化[22]。动物实验也发现，应用IL-17单抗后可抑制肺部中性粒细胞的募集[23]。本研究发现，IL-17在病例组（包括治疗前和治疗后）均比对照组明显增高，提示CMA患儿体内可能存在炎症反应的失衡。

IL-21由活化的各亚型CD4+T细胞产生，对多种免疫细胞有重要调节作用，Korn等[24]发现IL-21能协同TGF-β通过非IL-6依赖途径使Th17细胞分化，而且能抑制Treg细胞的表达和活性[25]。Treg细胞能维持免疫系统对自身成分的耐受，使机体保持免疫稳态。杨希晨等[26]研究发现，CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞有助于减少牛奶蛋白过敏的发生，并帮助诱导免疫耐受。本研究发现，IL-21在病例组水平比对照组明显增高，提示其可能通过活化Th17和抑制Treg细胞造成CMA患儿炎症状态。此外，单独分析耐受失败的3例患儿发现，其治疗前后IL-17、IL-21水平比较差异均无统计学意义（P>0.05），推测还有其他因素参与到CMA发病机制中。endprint

综上所述，Th17细胞比例及IL-17、IL21水平在CMA患儿及健康对照组中存在差异，可能为CMA研究及治疗提供了靶向依据。但是本研究病例数少，且未对Th17细胞上游及下游具体机制进行研究，存在局限性，有待进一步的研究。

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