王勇+王秀月+梁永娟+张广润+楚惠媛+陈彻

【摘要】 目的：探讨As2O3（arsenic trioxide，As2O3）联合运用丹参酮ⅡA（Tanshinone ⅡA，Tan ⅡA）对结肠癌SW620细胞迁移和侵袭的影响，并探讨联合用药与单独用药的差异。方法：应用MTT法检测不同浓度As2O3、Tan ⅡA及两药的联合用药对人结肠癌SW620细胞的增殖抑制作用，确定最佳联合用药浓度；分别用As2O3和Tan ⅡA以及两药联合处理结肠癌SW620细胞，同时以未经药物处理的SW620细胞作为空白对照，5-氟脲嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU）处理组为阳性对照组。应用Transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力的变化。结果：MTT试验结果表明，As2O3（2.5 μg/mL）联合Tan ⅡA（10 μg/mL）为最佳联合用药浓度。经As2O3和Tan ⅡA联合干预后，SW620细胞的迁移和侵袭能力比空白对照及单药组明显降低（P<0.01）。结论：As2O3联合Tan ⅡA作用能够明显抑制人结肠癌SW620细胞的侵袭转移能力。

【关键词】 结肠癌； 侵袭转移； 三氧化二砷； 丹参酮ⅡA； 抗肿瘤

【Abstract】 Objective：To discuss the effect of arsenic trioxide （As2O3） combined with Tanshinone ⅡA （Tan ⅡA） on the migration and invasion of colon cancer SW620 cells，and to explore the difference between the combination with medication alone.Method：MTT assay was used to detect the inhibitory effect of As2O3，Tan ⅡA and two drugs on the proliferation of human colon cancer SW620 cells.The best combination concentration was determined.The combination of As2O3 and Tan ⅡA and two drugs were used to treat colon cancer SW620 cells，While the untreated SW620 cells were used as blank control，5-fluorouracil （5-FU） treated group was positive control group.Transwell migration and invasion experiments were used to detect changes in fine walking and invasive ability.Result：MTT assay showed that As2O3（2.5 μg/mL） combined with Tan ⅡA（10 μg/mL） was the best combination concentration.With the combination of As2O3 and Tan ⅡA，the migration and invasion ability of SW620 cells were significantly lower than those of blank control group and single drug group（P<0.01）.Conclusion：As2O3 combined with Tan ⅡA can significantly inhibit the invasion and metastasis of human colon cancer SW620 cells.

【Key words】 Colon cancer； Migration and invasion； As2O3； Tanshinone ⅡA； Antitumor

First-authors address：Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.28.007

結肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，其死亡率和发病率逐年升高[1]，目前治疗手段以早期切除及放化疗为主，但易复发和转移的特点，给其治疗过程带来了难题[2]。有研究表明，结肠癌患者发生肝转移的概率高达50%[3]。因此，通过采取有效的治疗手段抑制结肠癌细胞的侵袭和转移，对结肠癌治疗具有重要意义。

As2O3作为一种剧毒致癌药物，2000年被FDA正式批准应用到急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）的治疗中[4]。此后，大量研究表明其对实体恶性肿瘤细胞有效。Wang等[5]的研究发现，As2O3可以抑制小鼠结肠癌的肺转移，然而As2O3的毒性作用限制了其在临床上的广泛应用，因此寻找减毒增效的用药方案是As2O3抗肿瘤研究中的重点。有研究表明，有些中药与化疗药物的联用可以减少药物的不良反应，并使每种药物疗效发挥最大作用[6]。Tan ⅡA是从丹参中提取出的脂溶性成分，近年研究发现其存在一定的抗癌活性。已有关于Tan ⅡA联合其他抗肿瘤化疗药物的研究：其可协同顺铂联合作用促进前列腺癌的凋亡[7]，可增强5-氟脲嘧啶（5-FU）对人结肠癌的抗肿瘤作用[8]。然而未见Tan ⅡA和As2O3联合对结肠癌细胞作用的报道。因此本研究采用MTT、Transwell、研究As2O3联合Tan ⅡA对人结肠癌SW620细胞游走及侵袭能力的影响，以期为抗结肠癌转移提供新思路，现报道如下。endprint

1 材料与方法

1.1 试剂及药物 Leibovitzs L-15培养液购自美国Gibco公司；胰蛋白酶和胎牛血清购自美国HyClone公司；PBS、青链霉素混合液、MTT试剂购自北京索萊宝科技有限公司；基质胶（Matrigel）购自美国BD公司，Transwell小室购自美国Corning公司；As2O3购自湖南省水口山矿务局衡阳实业总公司，Tan ⅡA购自上海第一生化药业有限公司，5-FU购自上海旭东海普药业有限公司。

1.2 细胞培养及处理 人结肠癌SW620购自上海中科院细胞库，细胞用含10%灭活胎牛血清、100 U/mL青链霉素混合液的Leibovitzs L-15培养液，置于37 ℃、CO2体积分数为5%且饱和湿度的细胞培养箱内培养，每2～3天传代、换液1次。

1.3 MTT法确定As2O3、TanⅡA及两药联合用药浓度 取处于对数生长期的SW620细胞，调整细胞密度为1×104个/mL，接种于96孔板中（100 μL/孔），边缘孔用PBS填充，细胞培养24 h后，对细胞进行分组及药物干预。实验分为空白对照组组（仅含培养液）、实验对照组（SW620细胞）、阳性对照组（SW620细胞用1000 μg/mL 5-FU进行干预）、As2O3单药组（SW620细胞分别用0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 μg/mL As2O3进行干预）、Tan ⅡA单药组（SW620细胞分别用0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL进行干预）、As2O3联合Tan ⅡA用药组（2.5 μg/mL+10 μg/mL Tan ⅡA联合干预），每组设5个复孔。药物作用72 h后，加入5 g/L的MTT溶液；培养4 h后，加入三联裂解液（10%SDS溶液+5%异丁醇溶液+0.1%盐酸溶液）；37 ℃孵育4～6 h，紫色结晶溶解后，将96孔板置于摇床上轻摇15 min；用酶标仪检测波长520 nm处各孔的光密度值（OD），按下列公式计算各用药组的细胞活性（Cell ability），Cell ability=OD用药组/OD实验对照组。

1.4 Transwell迁移和侵袭实验检测各组药物作用后SW620细胞的迁移和侵袭能力 收集无血清饥饿培养12 h后的SW620细胞1×104个，稀释于200 μL无血清的Leibovitzs L-15培养液中，加入Transwell上室；下室加入600 μL含20%胎牛血清的Leibovitzs L-15培养液。实验分为5组：空白对照组（无药物干预）、阳性对照组（5-FU干预组）、As2O3单药组（2.5 μg/mL）、Tan ⅡA单药组（10 μg/mL）、As2O3联合Tan ⅡA用药组（2.5 μg/mL As2O3与10 μg/mL Tan ⅡA 联合）。培养48 h后，用棉签拭去上室面的细胞，经3.7%甲醛溶液固定，100%甲醇溶液脱水，然后进行结晶紫染色。光学显微镜下随机选取中央及四周的5个视野，计数下室面附着的细胞数，来反映细胞的转移能力。重复实验3次。在Transwell上室膜（孔径为8 μm的聚碳酸酯膜）上涂布无血清Leibovitzs L-15培养液稀释的Matrigel（模拟细胞外基膜）40 μL，37 ℃反应1 h成胶，然后紫外线照射过夜。第2天，将饥饿培养12 h后的SW620细胞计数4×105个，稀释于200 μL的无血清Leibovitzs L-15培养液中，加入上室；剩余步骤同Transwell迁移实验。计数穿膜细胞数，来反映细胞的侵袭能力。实验重复3次。

1.5 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，多组间数据采用单因素方差分析或F检验，组内数据两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 检测As2O3或Tan ⅡA处理后的SW620细胞活力 As2O3（2.5 μg/mL）联合Tan ⅡA（10μg/mL）抑制结肠癌SW620细胞的生长，且两者具有协同作用。MTT结果显示，As2O3对SW620作用的72 h半数抑制浓度（halfinhibitory concentration，IC50）在2.5 μg/mL附近，而Tan ⅡA的72 h IC50约为10 μg/mL（图1、2），且两药都存在时间-剂量依赖关系。因此本研究取As2O3（2.5 μg/mL）和Tan ⅡA（10 μg/mL）作为用药浓度，通过联合用药组的细胞存活率（0.358±0.010）与As2O3组的细胞存活率（0.497±0.041）、TanⅡA组的细胞存活率（0.565±0.012）、5-FU单药组的细胞存活率（0.572±0.038）比较，发现联合用药的细胞存活率明显降低。且两药联合应用时，对细胞的生长抑制作用明显高于As2O3、Tan ⅡA及5-FU单药组（F=59.940，P<0.05），见图3。各单药组之间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。

2.2 As2O3联合Tan ⅡA作用对SW620细胞迁移及侵袭能力的影响 Transwell迁移实验结果显示，药物作用48 h后在显微镜下计数穿膜的SW620细胞，单因素方差分析5组之间的穿膜细胞数，差异均有统计学意义（F=720.372，P<0.01）；As2O3单药组、Tan ⅡA及5-FU单药组和联合组的穿膜细胞数分别为（54.33±4.04）、（80.33±5.03）、（89.33±4.04）、（24.00±4.00）均明显少于空白对照组的（237.00±8.19）（P<0.01）；且联合组的穿膜细胞数明显少于各单药组（P<0.01）。Transwell侵袭实验结果显示，药物作用48 h后在显微镜下计数穿膜的SW620细胞，单因素方差分析5组之间的穿膜细胞数，差异有统计学意义（F=21.351，P<0.01）；As2O3单药组、Tan ⅡA及5-FU单药组和联合组的穿膜细胞数分别为（21.00±3.60）、（29.67±3.51）、（30.67±3.05）、（13.67±3.51）均明显少于空白对照组的（39.67±4.73）（P<0.01）；且联合组的穿膜细胞数明显少于各单药组（P<0.01）。见图4、5。endprint

3 讨论

肿瘤细胞的侵袭转移能力是恶性肿瘤最基本的特性，也是导致肿瘤患者死亡的重要原因[9]。结肠癌细胞的侵袭转移是结肠癌发展的重要过程，抑制结肠癌细胞的侵袭可能提高结肠癌术者的预后[10-12]。近年来越来越多的研究表明，As2O3和Tan ⅡA分别在结肠癌的治疗过程中都具有抑制结肠癌肿瘤细胞转移和侵袭的作用[13-16]，联合药物治疗结肠癌的研究也越来越多[17-20]，然而就As2O3和Tan ⅡA两者联合应用，是否能够抑制结肠癌细胞侵袭和转移，目前未见报道。本研究应用Transwell迁移及侵袭实验检测了As2O3和Tan ⅡA单药及两者联合用药对SW620细胞迁移和侵袭能力的影响。结果显示，联合用药组对SW620细胞的活力，迁移和侵袭的抑制作用超过明显超过两单药组。

综上所述，As2O3联合Tan ⅡA具有抗人结肠癌SW620细胞迁移和侵袭的能力，联合两者用药是很有前途的抗结肠癌治疗手段，为临床上治疗结肠癌提供了新思路。肿瘤的侵袭转移是极为复杂度动态调节过程，是疾病发生发展的重要因素，其具体作用机制有待进一步研究。

参考文献

[1] Purushotham A D，Lewison G，Sullivan R.The state of research and development in global cancer surgery[J].Annals of Surgery，2012，255（3）：427.

[2] Zhang Q，Sha S，Xu B，et al.Prevalence of colorectal cancer in patients with ulcerative colitis：a retrospective，monocenter study in China[J].J Cancer Res Ther，2015，11（4）：899-903.

[3]陈冲，闫智勇.结肠癌肝转移动物模型研究进展[J].现代中西医结合杂志，2012，21（1）：98-100.

[4] Subbarayan P R，Lima M，Ardalan B.Arsenic trioxide/ascorbic acid therapy in patients with refractory metastatic colorectal carcinoma：a clinical experience[J].Acta Oncologica，2007，46（4）：557-561.

[5] Wang L，Hu X，Xu Y，et al.Arsenic trioxide inhibits lung metastasis of mouse colon cancer via reducing the infiltration of regulatory T cells[J].Tumour Biol，2016，37（11）：15 165-15 173.

[6] Chen Y Z，Li Z D，Gao F，et al.Effects of combined Chinese drugs and chemotherapy in treating advanced non-small cell lung cancer[J].Chinese Journal of Integrative Medicine，2010，15（6）：415-419.

[7] Hou L L，Xu Q J，Hu G Q，et al.Synergistic antitumor effects of tanshinone ⅡA in combination with cisplatin via apoptosis in the prostate cancer cells[J].Acta Pharm Sin，2013，48（5）：675-679.

[8] Chincheng S U.Tanshinone ⅡA potentiates the efficacy of 5-FU in Colo205 colon cancer cells in vivo through downregulation of P-gp and LC3-Ⅱ[J].Experimental & Therapeutic Medicine，2012，3（3）：555-559.

[9]李圣杰.循环肿瘤微栓的生物学特性和临床意义[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2016，23（4）：560-565.

[10]胡光明，黄平.结直肠癌肝转移预后评估最新进展[J].现代医药卫生，2016，32（12）：1861-1864.

[11]凌旭坤，陈创奇.淋巴结转移评估与结直肠癌预后关系的研究进展[J].消化肿瘤杂志：电子版，2016，8（2）：116-120.

[12]孙增峰，孙亚方，谈丽彩，等.结直肠癌脑转移的临床特征及预后因素分析[J].中华肿瘤杂志，2016，38（1）：63-68.

[13]常圆，杨甜，关景明.三氧化二砷在消化系恶性肿瘤治疗中的作用[J].世界华人消化杂志，2012，20（28）：2691-2696.

[14]刘宣，王炎，李丹光，等.丹参酮ⅡA对COX-2激活Wnt/β-catenin信号通路介导的人肠癌细胞VEGF表达的调控作用[J].中华中医药杂志，2013，28（1）：108-112.

[15]王垒.三氧化二砷降低结肠癌肺转移小鼠调节性T细胞的实验研究[D].大连：大连医科大学，2015.

[16]冯金红，郑婷，侯召华，等.隐丹参酮抗肿瘤及抗血管生成活性研究[J].中国生化药物杂志，2017，37（3）：30-33.

[17]梁有卓，陳灿锋.三氧化二砷及紫杉醇对人结肠癌细胞MTA1 mRNA表达水平影响研究[J].国际检验医学杂志，2017，38（11）：1461-1463.

[18]何胜利，沈婕，徐选福，等.厚朴酚联合5-FU对人结肠癌HCT-8细胞增殖和SFRP-4表达的影响[J].肿瘤，2016，34（12）：1097-1101.

[19]赵建国，叶万立，吴东平，等.替吉奥联合奥沙利铂治疗晚期结肠癌前后血浆miR-21表达水平变化及其临床意义[J].中国临床药理学与治疗学，2016，21（3）：318-321.

[20]毛跃伟，杨松鹏，高磊，等.奥沙利铂联合卡培他滨治疗晚期结肠癌的临床研究[J].中国临床药理学杂志，2016，32（14）：1286-1288.endprint