杜 杨 杨婧芳 宋 冉 侯华萍

（1.河南省安阳市畜产品质量安全监测检验中心，河南安阳 455000；2.河南省安阳市动物卫生监督所，河南安阳 455000；3.河南省安阳市畜牧兽医技术推广站，河南安阳 455000；4.河南省安阳市畜产品质量安全监测检验中心，河南安阳 455000）

生鲜乳中三聚氰胺检测改进方法试验方案

杜 杨1杨婧芳2宋 冉3侯华萍4

（1.河南省安阳市畜产品质量安全监测检验中心，河南安阳 455000；2.河南省安阳市动物卫生监督所，河南安阳 455000；3.河南省安阳市畜牧兽医技术推广站，河南安阳 455000；4.河南省安阳市畜产品质量安全监测检验中心，河南安阳 455000）

三聚氰胺（Melamine）是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要有机化工原料，具有肾毒性，能导致人体肾结石，甚至肾衰竭而被强制限量。2008年10月7日，国家质检总局、国家标准委员会发布了GB/T22388-2008国家标准，对三聚氰胺的检测有高效液相色谱法（HPLC），液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）和气相色谱-质谱联用法（GC-MS）。目前液相色谱配合紫外检测器或二极管阵列是最常用的检测方法，但其不足在于前处理时间长、步骤复杂，降低检测效率。与国标法相比，改进的方法不采用三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤、更换流动相中离子对试剂缓冲液与乙腈的比例及试剂，更换提取液试剂，共可降低约40%的检测成本，节省约2倍的处理时间。

三聚氰胺检测；国标方法；改进方法；回收率；高效率；低成本

1 试剂与仪器

1.1 试剂

甲醇、乙腈均为色谱纯，三氯乙酸、柠檬酸均为分析纯，氨水（25～28%），辛烷磺酸钠色谱纯，三聚氰胺对照品纯度≥99.0%。

1.2 仪器和设备

高效液相色谱仪，配有紫外检测器或二极管阵列检测器，高速冷冻离心机，固相萃取装置，涡旋混合器，阳离子交换固相萃取小柱（MCX），氮吹仪等。

2 方法与结果

2.1 标准储备液配制及标准曲线的绘制

准确称取100 mg（精确到0.1 mg）三聚氰胺标准品于100ml容量瓶中，用去离子水溶解并定容至刻度，配制成浓度为1 mg/ml的标准储备液，于4℃避光保存。准确移取5.0 ml三聚氰胺标准贮备液，置于50ml容量瓶中，用20%甲醇稀释至刻度，配制成浓度为100ug/mL的稀释液。用20%甲醇将稀释液逐级稀释得到的浓度为0.0、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0ug/ml的标准工作液。三聚氰胺最低定量限为2.0 mg/kg。（校正曲线色谱图第13页）

2.2 三聚氰胺样品前处理

称取样品2g左右（精确到0.01g）置于50ml塑料离心管中，加18ml三氯乙酸和乙酸铅混合液（三氯乙酸：乙酸铅=50：2 V：V），涡旋2min，超声提取25min，12000r离心10min，取5mL上清液待用。MCX小柱分别用3mL甲醇，3ml水活化。5ml上清液全部过柱，流速1ml/min。3ml水、3ml甲醇洗涤后挤干，3ml氨水甲醇洗脱，50℃下氮气吹干，2ml20%甲醇溶液复溶，复溶液过0.22μm滤膜，供HPLC测定。

2.3 HPLC的测定方法

色谱柱：C8柱，（150mm×4.6 mm）；流动相：离子对试剂缓冲液-乙腈（94∶6，V：V），离子对试剂缓冲液（准确称取2.10 g柠檬酸和2.02 g庚烷磺酸钠于1L容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度。）流速：1.0ml/min；柱温：30℃；波长：240 nm；进样量：20μl。

2.4 方法检验

（1）重复性。将2.50μg/ml的三聚氰胺标准溶液，重复进样7次。实验结果：保留时间的相对标准偏差为0.35 %，峰面积的相对标准偏差为1.21%。（图谱见附件2第16～20 页）

（2）改进方法的准确度实验。以加标回收率计算，在生鲜乳样品中加入标准溶液，使添加的浓度为2.5、5.0、10.0、20.0ug/mL，按“2.2”项的方法对同一样品平行处理，供HPLC测定，计算回收率。回收率＞90%，精密度（RSD）＜7%（表1）。（图谱见附件2第23～42页）

（3）国家标准的准确度试验 采用国家标准（GB/T22388-2008）HPLC法中的方法处理样品，乳制品按“2.4.2”项加入标准液，并对同一样品平行处理，供HPLC测定，计算回收率及精密度（表1）。（图谱见附件3第44～65页）

表1 2种检测方法加标回收率实验结果比较（n=5）

（4）2种检测方法测定结果比较 改进的方法与国家标准方法对上述乳制品加标，改进方法测定生鲜乳平均回收率在95～110%，国家标准方法测定回收率在80～95%。在检测限相同的条件下，改进方法样品前处理的时间为60～70min，样品检测成本约为30元，国家标准方法样品前处理的时间为120 min，样品检测成本约为50元。

3 讨论

国家标准的前处理用三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤离心液，1%的三氯乙酸沉淀蛋白，容易堵塞固相萃取（SPE）小柱，延长了处理时间。本研究显示：部分三聚氰胺被沉淀物物理吸附，并在离心过程中随乳制品基质发生沉淀，有可能在过滤的过程中滤纸也吸附少量的三聚氰胺。

改进方法的回收率为95～110%，精密度RSD＜7%符合国家标准要求（RSD＜15%）准确度好，精密度高。与国标法相比，改进的方法不采用三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤、更换流动相中离子对试剂缓冲液与乙腈的比例及试剂，更换提取液试剂，共可降低约40%的检测成本，节省约2倍的处理时间。综合比较认为，本方法具有快速、成本低、灵敏度高、精密度好等特点，尤其适用于大批量生鲜乳样品中三聚氰胺的检测。

4 经济效益及社会效益

在检测限相同的条件下，改进方法样品前处理的时间为60～70min，样品检测成本约为30元，国家标准方法样品前处理的时间为120 min，样品检测成本约50元。按照一年做200批次样品，共可节省成本约4000元，并且样品前处理批次可以扩大2倍。为加大对生鲜乳的监管力度和保障食品安全带来了不可估量的社会效益。

[1]蒋晨阳，谢国莲，刘满萍，等.生鲜乳中三聚氰胺检测方法的试验研究[A].首届中国兽药大会暨中国畜牧兽医学会动物药品学分会2008年学术年会[C].2008：145.