张积广　叶明凡

【摘要】 目的：探讨组蛋白H3K27三甲基化（H3K27me3）在肺癌中的表达及其临床意义。方法：收集笔者所在科2006年3月-2016年8月75例肺癌患者的病灶组织及其周围正常肺组织，采用组织阵列检测（TMA）技术检测组蛋白H3K27me3在肺癌组织及周围正常肺组织中的表达，采用免疫反应积分法（IRS）进行评估和比较。结果：肺癌组织的平均IRS得分为（4.40±1.63）分，显著高于正常组织的（0.74±0.28）分，差异有统计学意义（P<0.05）；H3K27me3蛋白的高表达与淋巴结转移、中-低分化肺癌和未分化肺癌、TNM分期Ⅱ～Ⅲ期有关，差异均有统计学意义（P<0.05），与性别、年龄、吸烟史、肿瘤直径、组织类型等无关，差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：肺癌H3K27me3可能与肺癌的发生、发展及转移有关，临床上对H3K27me3表达水平进行检测，可能对疾病的发展、预后具有重要意义。

【关键词】 肺癌； H3K27三甲基化； 临床

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.20.017 文獻标识码 B 文章编号 1674-6805（2017）20-0040-02

表观遗传学是指DNA序列不发生变化，但基因表达却发生了可遗传的改变，而表观遗传修饰主要包括DNA甲基化、组蛋白乙酰化和甲基化等[1]。组蛋白甲基化修饰在基因表达和染色体结构调节上发挥关键作用，通过影响染色体结构“开放”或“关闭”，控制基因转录的激活或抑制[2]。组蛋白H3的N-末端赖氨酸残基K27（H3K27）是主要的甲基化修饰位点之一，在体内有单甲基化（mel）、二甲基化（me2）及三甲基化（me3）形式[3]，其甲基化程度可影响相应区域DNA的转录活性，从而发挥转录抑制作用[4]。本研究通过组织阵列检测（TMA）技术检测全基因组蛋白H3K27三甲基化（H3K27me3）在肺癌组织中的表达及其临床意义，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2006年3月-2016年8月笔者所在科收治的成人肺癌病灶组织及其周围正常肺组织（距离癌肿>5 cm），各75例，患者男51例，女24例，年龄37～78岁，平均（62.8±6.3）岁。所有患者术前均未进行放疗、化疗或免疫治疗，所有病例术后病例诊断报告均显示为原发性肺癌，其中鳞状细胞癌37例，腺癌29例，大细胞癌6例，小细胞癌3例；其中高分化肺癌24例，中-低分化肺癌46例，未分化肺癌5例；发生淋巴结转移39例，无淋巴结转移36例；TNMⅠ期25例，Ⅱ期19例，Ⅲ期31例。

1.2 方法

检测组蛋白H3K27me3的表达，具体如下：（1）构建肺癌TMA，在光学显微镜下标记标本无坏死或退变、有肺癌代表性的区域，用打孔针（直径1.5 mm）于Quick-Ray预铸受体蜡块（韩国UNITMA公司）上打孔后即可取出2份圆柱形组织，分别将两块组织放入2个受体蜡块进行对比，60块组织/蜡块方阵，共5个TMA模块。将组织蜡块方阵置于52 ℃恒温烤箱内加热1 h，室温冷却30 min，然后置于-20 ℃冷却6 min。采用全自动轮转式切片机（型号：Leica RM2255，由德国Leica公司生产）切片，厚度为4 μm。将切片置于45 ℃温水，切片充分舒展后采用组织芯片载玻片（上海桑戈生物科技有限公司）将切片捞起、室温中晾干，置于95 ℃摊烤片机内烤干后，调至60 ℃烤16 h，室温冷却后放在-20 ℃冰箱内备用；（2）免疫组织化学方法染色，将切片置于60 ℃温箱内孵育30 min，用二甲苯脱蜡、梯度浓度酒精水化后，置于高压蒸汽中加热抗原修复，然后用0.3%甲醛/H2O2对内源性过氧化物酶进行封闭。加入羊血清，常温孵育1 h后，加入H3K27me3兔抗人多克隆抗体（1∶200）（美国Cell Singnaling Technology公司生产），置于4 ℃冰箱内过夜。切片加入HRP标记山羊抗兔IgG抗体后孵育1 h，置于4 ℃冰箱30 min，再置于DAB溶液中10 min，梯度浓度酒精脱水后置于二甲苯中透明，盖上玻片后用中性树脂封片，待晾干即可观察；（3）结果的判读，所有切片均经本院病理科2位临床病理医师对切片HE染色及免疫组化染色进行独立阅片。

1.3 观察指标及评价标准

采用免疫反应积分法（IRS）：（1）染色强度的积分，以胞浆或胞核内棕黄色颗粒为阳性标准，分为：①棕褐色颗粒为强阳性，3分；②棕黄色颗粒为阳性，2分；③淡黄色颗粒为弱阳性，1分；④无着色为阴性，0分；（2）阳性细胞百分比积分，计数5个高倍镜视野内细胞中的阳性细胞百分比：①>75%，4分；②51%～75%，3分；③26%～50%，2分；④0～25%，1分；IRS得分=染色强度积分×阳性细胞百分比积分，每个病例得分取两个重复样本之均值[5]。

1.4 统计学处理

本研究数据采用SPSS 17.0统计学软件进行分析和处理，计量资料以（x±s）表示，正态计量资料组间比较采用t检验，组间多重比较采用LSD-t检验，计数资料以率（%）表示，采用字2检验，，P<0.05视为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺癌组织与正常肺组织内组蛋白H3K27me3表达水平比较

肺癌组织的平均IRS得分显著高于正常组织，差异有统计学意义（P<0.05）

2.2 组蛋白H3K27me3的表达与肺癌临床病理因素的关系

H3K27me3蛋白的高表达与淋巴结转移、中-低分化肺癌和未分化肺癌、TNM分期Ⅱ～Ⅲ期有关，差异均有统计学意义（P<0.05），与性别、年龄、吸烟史、肿瘤直径、组织类型等无关，差异均无统计学意义（P>0.05）

3 讨论

国家癌症中心2015年发布的数据显示，2006-2011年我国肺癌5年患病率是130.2（1/10万），在男性恶性肿瘤中居第2位，在女性恶性肿瘤中居第4位[6]。尽管肺癌的治疗取得了进步，死亡仍是绝大多数肺癌患者的最终结局，因此，要发展更有效的肺癌诊疗方法，研究肿瘤形成的分子机制是至关重要的课题[7]。endprint

越来越多研究显示，表观遗传学可通过自分泌循环通路、原癌基因和抑癌基因这三个因素的调控影响肺癌的发生、发展[8]。组蛋白是染色质的基本组成单位，而组蛋白尾部的某些氨基酸残基发生的翻译后修饰可改变染色质结果，从而影响基因表达[9]。组蛋白的修饰方式主要有甲基化、乙酰化和磷酸化。组蛋白H3的N-末端赖氨酸残基K27（H3K27）是主要的甲基化修饰位点之一，其甲基化是一个抑制基因转录的关键介质，能引发重要的生物学功能[10]。文献[4]报道，H3K27me3在肝细胞癌、膀胱癌中高表达，预示预后差，而在胰腺癌和妇科恶性肿瘤中预后良好，提示H3K27在不同肿瘤中与特定基因关联，通过甲基化调控特定抑癌基因和原癌基因活性，从而影响疾病的临床预后。本研究采用組织阵列检测（TMA）技术对75例肺癌病理标本及癌旁正常肺组织进行组蛋白H2K27me3检测，通过免疫反应积分法（IRS）综合考虑病理组织的染色强度和阳性细胞百分比这两个因素。结果显示，肺癌病理组织内的组蛋白H2K27me3表达水平显著高于正常组织，差异有统计学意义（P<0.05），且组蛋白H2K27me3的表达与淋巴结转移、中-低分化肺癌和未分化肺癌、TNM分期Ⅱ～Ⅲ期有关，差异有统计学意义（P<0.05），表明组蛋白H2K27me3的高表达与肺癌的发展、转移关系密切。其机制可能是组蛋白H3K27me3抑制抑癌基因的转录[11]，影响细胞周期的调控，从而使得抑癌基因沉默，最终影响肿瘤的发生、发展及预后。

综上所述，肺癌细胞内组蛋白H2K27m3高表达可能与疾病的发生、发展关系密切，临床上对其进行检测，可能对疾病的发展、治疗、预后判断具有重要临床意义。

参考文献

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（收稿日期：2017-03-08）endprint