2株石油降解菌的分离鉴定

2017-11-13詹亚斌马立安陶兴玲何山文王鹏宇邓刚

长江大学学报(自科版) 2017年18期

关键词：菌落引物菌株

詹亚斌，马立安，陶兴玲何山文，王鹏宇，邓刚

长江大学生命科学学院，湖北荆州 434025

江涛

(长江大学动物科学学院，湖北荆州 434025)

2株石油降解菌的分离鉴定

詹亚斌，马立安，陶兴玲何山文，王鹏宇，邓刚

长江大学生命科学学院，湖北荆州 434025

江涛

(长江大学动物科学学院，湖北荆州 434025)

为了筛选高效石油降解菌株，通过富集驯化培养，从江汉油田石油污染土样中筛选能以石油为唯一碳源生长的菌株。经过划线培养获得单菌落，并通过形态观察、生理生化及分子生物学分析对菌株进行了初步鉴定和系统分类。结果分离获得2株石油降解效率较高的菌(分别记为G-40和G-94)，初步鉴定G-40为侧孢芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)，G-94为热带假丝酵母菌(Candidatropicalis)。

石油；降解菌；分离；鉴定

石油在开采、运输、加工、储存过程中不可避免地会发生石油泄漏事故，造成土壤及水体的严重污染，直接或间接危害人类健康。石油污染日益严重，对其治理已经刻不容缓[1]。

由于生物修复技术具有环境友好、成本低廉、操作简单、对操作人员危害小、作用彻底等特点，越来越引起人们的重视，被广泛应用到环境污染治理领域[2～4]，成为一种替代化学和物理技术的修复石油污染土壤的新技术。

土壤中存在着许多可以利用有机物的微生物，主要有细菌、真菌、放线菌等，它们具有氧化分解有机物的能力。在许多条件下，降解菌驯化时间长、生长速度慢、代谢活性不高，并且很不稳定，因此筛选一些稳定高效降解污染物的菌种，是生物修复的必然要求[1]。

本课题组从江汉油田石油污染土壤中分离获得石油降解单菌，为后期研究其石油降解特性做准备，同时也为石油污染土壤生物修复提供微生物资源。

1 材料与方法

1.1材料

石油污染土样采自江汉油田作业油井及废弃老井附近，离地表20～25cm的土壤，多点采样后装入无菌袋中密闭保存备用。所有试剂均为分析纯或化学纯。

富集、驯化培养基制作方法参考文献[5]，马铃薯蔗糖液体培养基、马铃薯蔗糖固体培养基、牛肉膏蛋白胨液体培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基、细菌选择性培养基、真菌选择性培养基(马丁-孟加拉红培养基)制作方法参考文献[6]。

1.2方法

1.2.1石油降解菌的富集、驯化与分离

称取新鲜的石油污染土壤样品约5g放入100mL无机盐培养基中，35℃、150r/min恒温摇床震荡培养5d，将菌液按照5%的接种量重新转接到新鲜的富集、驯化培养基中，以5d为1个周期，连续培养3个周期，获得能以石油作为唯一碳源和能源的混合菌群[5]。

菌株纯种分离：将混合菌群培养液稀释涂布于细菌/真菌选择性培养平板中，在35℃恒温培养箱中培养48h，根据菌落形态特征挑取不同单菌落，在细菌/真菌选择性培养基上多次划线纯化后，再挑选单菌落保种于牛肉膏蛋白胨/马铃薯蔗糖试管斜面中，同时采用终浓度20%灭菌甘油冻管法保存于-80℃条件下。

1.2.2石油降解率的测定

将分离纯化获得的细菌/真菌挑取一环，接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基/马铃薯蔗糖液体培养基中，取生长在对数期的菌液，以5%(v/v)的接种量接入到石油培养基中，35℃、pH 7.0、150r/min恒温摇床震荡培养30d，测定石油降解率。

采用重量法测定石油降解率。向含油三角瓶中分4次加入80mL二氯甲烷，萃取出石油，经过无水硫酸钠柱除水后，室温晾干直至有机溶剂完全挥发。将石油放置真空干燥箱40℃，真空度0.04MPa下保持30min后，取出置于干燥器中30min，称重，重复3次[5]。石油降解率按如下公式计算：石油降解率=[(空白石油烃浓度-培养液石油烃浓度)/空白石油烃浓度]×100%。

1.2.3菌体形态与培养特征的观察

菌体染色后在显微镜下观察细胞形态。在牛肉膏蛋白胨/马铃薯蔗糖琼脂培养平板上观察菌落特征。

1.2.4生理生化性质测定

按照文献[6]的方法，对该菌株进行生理生化性质测定，分别包括：明胶液化试验、吲哚试验、过氧化氢酶试验、柠檬酸盐试验、甲基红试验、乙酰甲基甲醇试验(V.P.)、淀粉水解试验、油脂水解试验、产氨试验、硝酸盐还原试验、苯丙氨酸脱氢酶试验、产硫化氢试验。重复3次，每次做3组，记录结果。

1.2.5分子生物学鉴定

细菌总DNA提取采用煮沸法[7]，真菌总DNA的提取采用CTAB法[8]。

以提取到的细菌DNA为模板，采用通用引物扩增16S rDNA，上游引物27F： 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，扩增反应于Bio-Rad PCR仪上进行。PCR反应体系为25μL，其体系为 2×PCR 12.5μL，27F(10μmol/L)1μL，1492R(10μmol/L)1μL，DNA模板2μL，双蒸水8.5μL。PCR 扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min 30s，30个循环；72℃终延伸10min。

以提取得到的真菌DNA为模板，采用通用引物扩增ITS rDNA，上游引物ITS 5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，下游引物ITS 4：5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；扩增反应于Bio-Rad PCR仪上进行。PCR反应体系为25μL，其体系为 2×PCR 12.5μL，ITS 5(10μmol/L)1μL，ITS 4(10μmol/L)1μL，DNA模板2μL，双蒸水8.5μL。PCR 扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃终延伸7min。

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，产物和Mark上样量均为5μL，电泳结果于Bio-Rad凝胶成像系统成像。PCR产物经AxyPrep PCR清洁试剂盒纯化；纯化后的PCR产物送生工生物(武汉)股份有限公司测序。测序结果在NCBI中进行BLAST比对分析，并通过软件MEGA 5.0构建系统发育树。

2 结果与分析

图1 2株菌株的石油降解率

2.1菌株分离结果

从污染土壤中分离获得2株石油降解单菌，分别记为G-40和G-94。

2.2分离菌株的石油降解率

从图1可以看出，G-40和G-94在35℃、pH7.0、油浓度2%、盐浓度0.5%、150r/min的条件下，石油降解率分别为21.59%和37.03%，两者之间具有显著差异(P<0.05)。

2.3菌体形态与培养特征

将2株菌分离培养后(G-40培养2d，G-94培养8d)，G-40和G-94的菌落形态分别见图2和图3，菌落特征见表1。

图2 G-40菌落和菌体(1000×) 图3 G-94菌落和菌体(1000×)

菌编号菌落形态颜色质地突起边缘直径/mm面积/mm2G⁃40圆形米黄色光滑凸透镜状完整201313G⁃94圆形乳白色光滑脐突状完整155018521

表2 2株菌株的生理生化试验结果

注：-代表阴性；+代表阳性。

2.4生理生化性质测定

分离获得的2株菌生理生化试验结果如表2。

2.5分子生物学鉴定

对降解菌株G-40的16S rDNA基因片段进行PCR扩增，最终获得长度约为1500bp的基因序列；对G-94的ITS rDNA基因片段进行PCR扩增，最终获得长度约为750bp的基因序列。将其与NCBI数据库中的已知序列进行BLAST比对分析发现，G-40与Brevibacilluslaterosporus的序列相似度达到99%，G-94与Candidatropicalis的序列相似度达到99%。根据结果进行2株菌株的系统发育分析如图4和图5所示。