张 薇 田 维 王彬彬*

1. 北京协和医学院研究生院(100730)；2. 国家卫生计生委科学技术研究所；3. 天津医院

*通讯作者：wbbahu@163.com

DLX3基因罕见变异与发育性髋关节发育不良

张 薇1,2田 维3王彬彬1,2*

1. 北京协和医学院研究生院(100730)；2. 国家卫生计生委科学技术研究所；3. 天津医院

目的：筛查DLX3基因(NM_005220)中发育性髋关节发育不良(DDH)相关的致病变异。 方法：本研究对192例DDH患者和188例健康对照组的DLX3基因全部外显子区进行Sanger测序，排除已知高频单核苷酸多态性(SNP)位点(最小等位基因频率MAF ≥ 1%)和对照组中存在的变异位点，结合功能性预测和保守性分析，最终筛选出DDH候选致病变异。 结果：经过分析，最终在一个DDH患者中筛选出一个错义杂合变异 DLX3 c. G736C: p. D246H(rs3744539)可能为其致病突变，此变异在物种进化过程中高度保守且致病的可能性较高。 结论：本研究首次对DLX3整个外显子区进行变异筛查，并发现新的DDH候选致病变异 p. D246H。

发育性髋关节发育不良；DLX3基因；错义变异；致病突变

发育性髋关节发育不良(DDH)是小儿骨科常见的先天性畸形，严重危害儿童的骨骼生长发育和身体健康[1-2]。DDH的发病率因地域、物种和经济医疗条件的不同而有所差异，全球总发病率在1.4‰～35‰，中国约1‰～5‰，女性的发病率显著高于男性(4～10:1)且左侧受累多于右侧[3-4]。DDH是一个世界范围内的医学难题，若能早期诊断并及时治疗，大部分患儿可完全正常发育；若治疗延误，将导致患儿最终形成不可逆的膝关节骨性关节炎和不同程度的残疾，严重影响患儿的生活质量，给家庭带来沉重的经济和精神负担。目前，DDH的发病原因及机制尚不明确，研究表明遗传因素和环境因素共同作用导致疾病的发生[3]。子宫内约束、羊水过少、臀位妊娠、初产、高出生体重和襁褓包裹不当等都可能为DDH的高风险环境因素[5]。流行病学和家系分析等研究表明，DDH具有明显的家族聚集性，遗传因素在疾病发生中起重要作用，同卵双胞胎比异卵双胞胎具有更高的一致性，DDH患者的一级亲属更易受到影响[6-7]。目前，已发现多个可能与DDH发生相关的候选基因，如HOX家族基因(HOXA， HOXB，HOXD)，胶原相关基因(COL1A1，COL1A2)，生长分化因子基因GDF5，雌激素受体基因ER和DLX家族基因DLX3，DLX4，DLX5等[4,8]。本研究对整个DLX3外显子区进行突变筛查，以期发现新的致病变异，为疾病的遗传学研究和分子诊断提供新的思路。

1 研究对象与方法

1.1研究对象

本研究纳入的192例DDH患者(DDH组)均来自于天津医院创伤外科，所有患者均由至少2名骨专科医师根据病史、体格检查、骨盆X光和CT照片结果进行确诊，且无其他综合征表型。健康对照组样本来自该院体检中心，将无任何髋关节和其他先天畸形、无遗传性疾病与DDH家族史的人群，按照性别、年龄和民族(研究对象均自述为汉族)相匹配的原则纳入188例研究对象作为对照组。上述DDH组和对照组中的研究对象均为不相关个体，彼此无血缘关系。本研究中所涉及的血液采集、临床信息资料收集等均通过天津医院与国家卫生计生委科学技术研究所伦理委员会批准，全部研究对象均由本人或监护人签署知情同意书，并在本人及家属知情的情况下进行。研究对象无菌采集外周静脉血2ml于EDTA抗凝管，-20℃保存备用。

1.2实验方法

1.2.1基因组DNA的提取及PCR扩增本研究采用QIAGEN公司QIAampDNA Blood Mini Kit(Cat. No.51106)试剂盒提取研究对象血液样本的基因组DNA，操作步骤严格按照配套说明书进行，并利用Nanodrop 2000分光光度计检测各样本DNA的浓度与OD260/OD280的比值(比值在1.6～1.8符合要求)。在UCSC数据库下载DLX3(NM_005220)基因序列，使用Primer Premier 5.0 软件设计3对匹配引物使扩增区域包含3个外显子及外显子前后各100bp区域，引物信息见表1。聚合酶链式反应(PCR)得到病例组(192例)和对照组(188例)特定区域的扩增产物并进行Sanger测序。

1.2.2测序结果比对及分析首先，利用Chromas 2软件判断测序质量，使用MegAlign软件将DDH组测序数据与DLX3基因序列进行比对以寻找潜在的变异位点并进行记录。其次，排除DDH组和健康对照组中同时存在的位点。然后，利用ExAC Browser在线数据库排除高频SNP位点(MAF≥1%)。最后，利用生物信息学软件对变异位点进行保守性预测、功能性预测和有害性预测，结合其可能对蛋白质功能和氨基酸性质所造成的生化机制的改变，最终确定DDH候选致病变异。

表1 DLX3外显子区扩增引物

2 结果

2.1确定DLX3 c. G736C: p. D246H变异

测序数据经过序列比对、排除以及预测等流程，最终在一个DDH患者中筛选出一个错义杂合变异 DLX3 c. G736C: p. D246H(rs3744539)(图1-A)。p. D246H导致酸性天冬氨酸变为碱性组氨酸，变异在ExAC Browser数据库中频率为0.000 7059，在亚洲人群中的比例0.009 727，属较罕见变异(Freq<1%)，且在健康对照组中未被发现。变异由Polyphen-2，SIFT和MutationTaster在线预测软件皆预测为致病性或可能致病(表2)，且在物种进化过程中高度保守(图1-B)。这位变异携带者由骨科专家根据体格检查、骨盆X光片和CT扫描片综合诊断为DDH疾病(图1-C, D)。

表2 DLX3 p. D246H 变异有害性预测

a.Polyphen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/). 预测分值范围0～1，分值越高表示危害性越大

b.SIFT (http://sift.jcvi.org/). 预测分值范围0～1，分值越接近于0危害性越大

c.Mutation Taster (http://www.mutationtaster.org/). 分值大小表示预测结果的可信度，分值越接近于1表示预测的可信度越高

A：错义杂合变异 DLX3 c. G736C；B：变异位点在物种进化过程中高度保守(人类、家牛、绵羊、小鼠和大鼠)；C: 变异携带者骨盆X光片；D: 变异携带者CT扫描片

图1发育性髋关节发育不良变异携带者基因比对及病例情况

3 讨论

DLX家族是HOX家族的分支之一，同属于同源异型盒基因家族，DLX家族基因参与调控胚胎形态发生，是骨骼发育过程中的重要转录因子[8]。多个连锁分析表明染色体17q21-22区域可能与DDH和骨质疏松等疾病表型相关，DLX3，DLX4与DLX5均位于这段DDH易感区域，可推测DLX基因与先天性骨骼畸形发生有关[9-10]。近几年，基于动物模型的研究，如DLX1与DLX2基因敲除小鼠出现异位骨成分，DLX5敲除小鼠长骨骨化轻度延迟，敲除或特异性抑制DLX3/DLX5的表达可显著抑制成骨细胞的基质成熟和矿化，以上研究更加提示了DLX家族基因对机体骨骼生长发育的重要性[11-12]。田维[13]前期对DLX3，DLX4和DLX5共8个单核苷酸多态性位点(SNPs)进行DDH病例-对照关联性分析，其中有5个位点与DDH密切相关，首次证明DLX3和DLX4基因可能与DDH的易感性相关。此外，研究学者们通过家系传递不平衡检验和连锁分析等研究策略，证实染色体17q21-17q22区域与DDH疾病的发生密切相关，而DLX家族基因DLX3，DLX4与DLX5均位于此DDH易感区域，进一步可推测DLX家族基因与DDH的发生具有紧密的联系[9-10,14]。

DLX3，位于染色体17q21，包含3个外显子，属DLX家族6个基因(DLX1-DLX6)中的一员，其编码的蛋白质参与调控转录因子活性、序列特异性DNA和染色质结合，在颅面模型、形态发生、皮肤和骨骼发育等过程中发挥重要作用[15]。多个研究表明，DLX3基因的移码突变和缺失突变都可能导致一种罕见的常染色体显性遗传性疾病毛发-牙-骨综合征(TDO)的发生，此病以头发卷曲、牙釉质发育不良、牙冠长根短和骨皮质增厚为特征[16-18]。研究发现，DLX3基因敲除小鼠在胚胎期9.5～10d死亡，因此无法观察其由于基因缺失导致的具体表型变化[19]。截止目前，只发现DLX3基因rs2278163，rs12452477和rs2303466这3个位点与DDH疾病相关，即3个位点的T，T，A等位基因和TT，CT(TT)，AA基因型可能是发育性髋关节发育不良的风险因子[13]。然而，DDH 是一种复杂的遗传病，不同个体之间存在很大的遗传异质性，且单纯的关联分析只能对少数位点进行研究，远不及探索整个候选致病基因或基因编码区与疾病的研究系统性强。

本研究首次针对DLX3基因全外显子区进行突变筛查，并发现一个新的候选致病变异DLX3 c. G736C: p. D246H，变异导致第246位酸性天冬氨酸变为碱性组氨酸。变异所在位点在物种进化过程中高度保守，且多个预测软件显示变异的致病可能性较大，其中MutationTaster预测变异可能导致选择性剪切位点的改变。DLX3蛋白由三个主要区域组成，分别为N端和C端反式激活结构域以及中间的同源结构域。其中，同源结构域在机体多个生长发育阶段可与DNA特异性相互作用以调节目标基因的表达[20]。因此，同源结构域内保守性氨基酸的突变往往导致较为严重的临床表型[21]。而两端反式激活结构域的缺失会导致DLX3作为转录因子功能的下降，表明这些副结构域在同源结构域-DNA结合中也发挥着较为重要的作用[20]。据报道，DLX3同源结构域内p.Q178R变异导致TDO疾病发生的可能机制为降低了RUNX2，OCN和p53等蛋白的表达，减少骨的生成以及延缓衰老功能的下降[22]。C端结构域变异p. D246H是否通过类似机制参与DDH疾病的发生，有待进一步深入探索。

由于DDH发病机制较为复杂，且家系样本采集困难，DDH的遗传学研究多集中于散发样本的关联分析或候选基因突变筛查，局限性较大，且发现的少数基因突变只能解释很小一部分DDH病例的发生。随着高通量测序技术与大数据生物信息学分析的发展和成熟，基于高发家系的全基因组测序、全外显子组测序及其他高通量测序将为DDH等复杂性疾病的致病基因鉴定带来广阔的前景。

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RarevariantofDLX3geneanddevelopmentaldysplasiaofthehip

ZHANG Wei1,2, TIAN Wei3, WANG Binbin1,2*

1.GraduateSchoolofPekingUnionMedicalCollege,Beijing, 100730; 2.NationalResearchInstituteforFamilyPlanning;3.TianjinHospital

Objective: To screen pathogenic variants associated with developmental hip dysplasia (DDH) in the DLX3 gene. Methods: 192 patients with DDH and 188 healthy research objects were recruited in this study. All exons coding of DLX3 of the included objects were amplified and sanger sequenced. The known high frequency SNPs (minimum allele frequency≥1%) and variation locus carried by healthy research objects were excluded, and the candidate pathogenic variant of DDH was selected ultimately through functional prediction combined with conservative analysis. Results: A heterozygous missense variant c. G736C: p. D246H (rs3744539) was identified in a patient and it was absent in healthy research objects. This variant was highly conserved in evolution of species and was predicted to be deleterious to the function of DLX3 protein. Conclusion: It is the first time to screen the entire exon region of DLX3 and to found a new DDH candidate pathogenic variant p. D246H.

Developmental dysplasia of the hip; DLX3 gene; Missense variant; Pathogenic mutations

10.3969/j.issn.1004-8189.2017.07.004

2017-03-23

2017-04-03

*Correspondingauthor:wbbahu@163.com

[责任编辑：王丽娜]