王唯嘉 康晓静 王朋 普文静 于世荣 赵娟 梁俊琴 梁胜男

830000乌鲁木齐，新疆维吾尔自治区人民医院皮肤性病科（王唯嘉、康晓静、王朋、于世荣、赵娟、梁俊琴、梁胜男），病理科（普文静）

哈萨克族毛囊角化病一家系ATP2A2基因突变研究

王唯嘉 康晓静 王朋 普文静 于世荣 赵娟 梁俊琴 梁胜男

830000乌鲁木齐，新疆维吾尔自治区人民医院皮肤性病科（王唯嘉、康晓静、王朋、于世荣、赵娟、梁俊琴、梁胜男），病理科（普文静）

目的探讨哈萨克族毛囊角化病一家系患者ATP2A2基因突变。方法收集哈萨克族毛囊角化病49人家系的临床资料，采集44名家系成员和100例无亲缘关系健康人外周血，提取基因组DNA。采用PCR和DNA测序对该家系进行ATP2A2基因突变检测。结果该家系毛囊角化病遗传方式属于常染色体显性遗传。家系中11例患者在ATP2A2基因12号外显子的剪切位点发生杂合突变（1288⁃1G→A），即第1288⁃1位碱基由G突变为A，而家系中33例正常成员及100例健康对照均未发现该突变。结论该家系毛囊角化病发病可能是由ATP2A2基因12号外显子的剪切位点发生杂合突变（1288⁃1G→A）所致。

Darier病；DNA突变分析；系谱；基因，ATP2A2；哈萨克族

毛囊角化病（keratosis follicularis，KF）又称Darier病是一种以表皮细胞角化不良为特征的常染色体显性遗传病，皮损多见于前胸、头、面、颈、四肢屈侧等脂溢性区域，表面富有油腻性鳞屑，多对称分布，可伴有掌跖角化以及特征性甲改变，日晒、潮湿和心理压力可使病情加重［1］。1993年，Bashir等［2］和Craddock等［3］对英国两个KF家系行连锁分析，首次将该病的致病基因定位于12q23⁃12q24.1上。到目前为止，国内外已报道超过187种ATP2A2基因突变（http：//hgmd.cf.ac.uk），包括错义突变、无义突变、同义突变、剪切位点突变、移码突变、单个碱基缺失或插入及动态突变等。KF患者中基因无突变热点，国外学者认为其突变分布有向ATP2A2基因两端集中的倾向［4］，目前尚未有哈萨克族KF患者基因突变的报告。哈萨克族是新疆维吾尔自治区人口较多的少数民族之一，与外界的交往较少，世居在草原上，哈萨克人有7代以内血缘关系者不能结婚，因此很少有近亲婚姻关系，从而减少了近亲结婚带来的遗传疾病。我们收集一少见的四代49人哈萨克族KF大家系［5］，应用PCR和DNA直接测序对ATP2A2基因进行突变检测，分析其与哈萨克族KF的相关性。

一、资料与方法

（一）临床资料：先证者（Ⅱ5）为58岁男性，哈萨克族，自10岁起无明显诱因在胸腹部出现数个米粒大皮疹，随年龄增长皮损逐渐增大，融合成不规则疣状物，皮损颜色为暗褐色，表面油腻，有糜烂渗出，伴轻微瘙痒感，夏季加重，冬季缓解，发病以来未曾诊治。入院前2个月四肢、手背部出现数个新发油腻性黑褐色丘疹，原皮损出现脓性渗出，伴恶臭，指甲增厚、质脆易裂。皮肤科检查：患者躯干四肢对称分布数个米粒至黄豆大小实性黄褐色毛囊性丘疹，覆盖油腻性棕色痂皮，部分丘疹可见糠状鳞屑，丘疹融合成多个椭圆形和不规则形疣状斑块，略高于皮面，见图1。腹部皮损组织病理：表皮角化不良伴棘层增厚，可见绒毛、圆体细胞和谷粒细胞，真皮浅层炎症细胞浸润（图2）。先证者母亲和女儿也表现出相似的临床特征。由先证者追溯调查该家系四代共49人，其中15人患病，家系中无近亲婚配史，见图3。根据病史、临床特点、病理学特点，15例患者均诊断为KF［5］。根据Sakuntabhai等［6］的诊断标准，将四代哈萨克族KF患者的临床表现分为轻度、中度和重度，其中4例为轻度（Ⅲ14、Ⅲ16、Ⅳ12、Ⅳ14），3例为中度（Ⅲ3、Ⅲ15、Ⅳ13），4例为重度（Ⅱ5、Ⅲ5、Ⅳ11、Ⅳ16），4例不详（Ⅰ2、Ⅱ1、Ⅱ3、Ⅲ7）。患者Ⅰ2、Ⅱ5患有冠心病，Ⅲ5患有高血压。四代中患者发病年龄均在青少年期，家系中未出现下一代较上一代临床症状更严重的现象。

图1 患者躯干四肢（1A［5］、1B）可见毛囊性丘疹，覆盖油腻性棕色痂皮

图2 皮损组织病理 表皮过度伴角化不全，棘层松解（HE×100）

（二）方法：

1.外周血基因组DNA提取：征得患者同意后，采集哈萨克族家系内43人外周血各5.0 ml，其中患者11例，未患病者32人，同时采集100例无亲缘关系的健康人外周血各5.0 ml，提取基因组DNA作为对照。血样均经2%乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，-80℃保存备用。采用DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取基因组DNA。

2.PCR扩增ATP2A2基因全部外显子：通过NCBI数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）查取ATP2A2基因mRNA序列，BLAST得到该基因序列，采用Primer3.0设计特异性引物对ATP2A2基因的21个编码外显子进行PCR扩增（http：//www.genome.wi.mit.edu/csi⁃bin/primer/primer3⁃www.cgi）。见表1。PCR反应：总体系25 μl，内含有200 ng基因组DNA，100 μmol/L dNTP，引物 4 pmol，1.2 mmol/L MgCl2和1 U 聚合酶（日本Takara生物技术公司）。每个反应的步骤为：95℃预变性5 min，然后进行35个循环：94℃变性30 s，52～56℃退火30 s，72℃延伸1 min。最后，将反应混合物在72℃中延伸5 min。所有PCR产物进行15 g/L琼脂糖凝胶电泳。PCR产物纯化及测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

二、结果

PCR产物测序发现，11例患者ATP2A2基因第12号外显子剪切位点1288⁃1位碱基由鸟嘌呤（G）转化为腺嘌呤（A）。而家系中未患病的32名成员及100例无亲缘关系的健康人均未见改变，故1288⁃1G→A为该家系的突变位点。见图4。

表1 ATP2A2基因21对外显子引物、产物大小及退火温度

图3 家系图

图4 ATP2A2基因12号外显子和内含子部分序列图 箭头所示为先证者ATP2A2基因的第1288⁃1位碱基发生G→A突变。4A：家系内患者；4B：正常家系成员；4C：无亲缘关系健康对照

三、讨论

KF是一种常染色体显性遗传的角化不良性皮肤病。Sakuntabhai等［7］将位于12q23⁃24.1区域内编码肌浆/内质网-ATP 酶 2（srco/endoplasmic reticulum Ca2+ATPase type 2，SERCA2）的ATP2A2基因进一步确定为KF的致病基因，该基因在皮肤角质形成细胞内高度表达。SERCA2为钙泵蛋白，其功能主要为调节细胞内钙离子浓度，在调节胞质内外钙离子浓度方面有重要作用。SERCA2属于P型钙离子ATP酶家族，也是内质网中大量钙离子聚集的离子泵。

我们收集一四代49人哈萨克族KF大家系，通过对ATP2A2基因分析，首次发现一个ATP2A2基因的剪切位点杂合突变，第12号外显子第1288⁃1位碱基由鸟嘌呤（G）转化为腺嘌呤（A），此突变可能导致ATP2A2基因在翻译过程中产生错误的剪切位点，致其翻译的ATP2A2核酸序列发生改变，进而影响其编码的SERCA2蛋白结构及功能。

本文哈萨克族KF家系遗传模式具有以下特点：①子女为患者，其父母至少一方患病；②家系中所有患者均携带有ATP2A2基因1288⁃1G→A剪切位点突变，健康成员中未检测具有ATP2A2基因突变；③一个患者的家族中，可以连续几代出现此病患者，呈垂直遗传；④无病的家系成员与健康人结婚，后代不再有此病。故该家系符合常染色体显性遗传［5］。家系中患者的突变位点相同，但病情严重程度、发病年龄不完全相同，部分患者伴发心血管疾病，可见，即使是同一家系、同一突变也可导致不同表型，这与Zheng等［8］研究相符。推测影响该家系表型的因素有：①家系中患者均携带有相同的ATP2A2基因1288⁃1G→A剪切位点突变，此突变可能是该家系患者的遗传学基础；②外界环境（如温度、湿度等）可能也作为KF的诱因影响该家系中患者表型；③该家系中部分患者（Ⅰ2、Ⅱ5、Ⅲ14）同时患有心血管疾病，虽不能明确其与KF之间的关系，但已有动物模型研究［9］提示在肌原纤维Ca2+敏感性增高的情况下，KF患者患心力衰竭的可能性提高。ATP2A2基因编码的SERCA2共有2个可变剪切体，SERCA2a及SERCA2b。SERCA2a主要分布在人类心肌与骨骼肌中，SERCA2b主要分布在皮肤和大脑的内质网中，不同突变导致SERCA2b各个单体的功能缺陷可相互影响，最终引起SERCA2b总体功能改变，导致表皮内角质形成细胞的黏附和分化功能异常，促进本病发生。虽然本研究不能证实ATP2A2基因突变是KF患者患心血管疾病的原因，但不排除该家系ATP2A2基因发生的杂合突变可能导致SERCA2单倍不足，从而导致患心血管疾病的可能性。

［1］Tavadia S,Mortimer E,Munro CS.Genetic epi⁃demiology of Darier′s disease:a population study in the west of Scotland［J］.Br J Dermatol,2002,146（1）:107⁃109.DOI:10.1046/j.1365⁃2133.2002.04559.x.

［2］Bashir R,Munro CS,Mason S,et al.Localisation of a gene for Darier′s disease［J］.Hum Mol Genet,1993,2（11）:1937⁃1939.

［3］Craddock N,Dawson E,Burge S,et al.The gene for Darier′s disease maps to chromosome 12q23⁃q24.1［J］.Hum Mol Genet,1993,2（11）:1941⁃1943.

［4］Miyauchi Y,Daiho T,Yamasaki K,et al.Comprehensive analysis of expression and function of 51 sarco（endo）plasmic reticulum Ca2+⁃ATPase mutants associated with Darier disease［J］.J Biol Chem,2006,281（32）:22882 ⁃22895.DOI:10.1074/jbc.M601966200.

［5］宋珍珍,徐益明,康晓静.毛囊角化病一家系15例［J］.中华医学遗传学杂志,2010,27（1）:113⁃114.DOI:10.3760/cma.j.issn.1003⁃9406.2010.01.048.

［6］Sakuntabhai A,Ruiz⁃Perez V,Carter S,et al.Mutations in ATP2A2,encoding a Ca2+pump,cause Darier disease［J］.Nat Genet,1999,21（3）:271⁃277.DOI:10.1038/6784.

［7］Sakuntabhai A,Burge S,Monk S,et al.Spectrum of novel ATP2A2 mutations in patients with Darier′s disease［J］.Hum Mol Genet,1999,8（9）:1611⁃1619.

［8］Zheng L,Jiang H,Mei Q,et al.Identification of two novel Darier disease⁃associated mutations in the ATP2A2 gene［J］.Mol Med Rep,2015,12（2）:1845⁃1849.DOI:10.3892/mmr.2015.3605.

［9］Prasad V,Lorenz JN,Lasko VM,et al.SERCA2 haploinsuffi⁃ciency in a mouse model of Darier disease causes a selective predisposition to heart failure［J］.Biomed Res Int,2015,2015:251598［2015⁃12⁃03］.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4433638.DOI:10.1155/2015/251598.

Mutation analysis of the ATP2A2 gene in a Kazakh family with Darier′s disease

Wang Weijia,Kang Xiaojing,Wang Peng,Pu Wenjing,Yu Shirong,Zhao Juan,Liang Junqin,Liang Shengnan
Department of Dermatology and Venereology,People′s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumqi 830000,China（Wang WJ,Kang XJ,Wang P,Yu SR,Zhao J,Liang JQ,Liang SN）;Department of Pathology,People′s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumqi 830000,China（Pu WJ）

Kang Xiaojing,Email:drkangxj666@163.com

ObjectiveTo analyze mutations in the ATP2A2 gene in a Kazakh family with Darier′s disease.Methods Clinical data were collected from 49 members from a family with Darier′s disease,and peripheral blood samples were obtained from 44 family members and 100 unrelated healthy people.Genomic DNA was extracted from these blood samples.PCR and DNA sequencing were performed to detect mutations in the ATP2A2 gene.ResultsDarier′s disease was inherited in an autosomal dominant manner in this family.A G→A heterozygous mutation（1288⁃1G→A）was identified at position 1288⁃1 at the splice site in exon 12 of the ATP2A2 gene in 11 patients in this family,but not in 33 healthy members or 100 healthy controls.ConclusionDarier′s disease in this family may be caused by the heterozygous mutation（1288⁃1G→A）at the splice site in exon 12 of the ATP2A2 gene.

Darier disease;DNA mutational analysis;Pedigree;Gene,ATP2A2;Kazakh

康晓静，Email：drkangxj666@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2017.09.015

国家自然科学基金（81360235）

Fund program:National Natural Science Foundation of China（81360235）

2016⁃08⁃25）

（本文编辑：尚淑贤）