唐美君，郭华伟，葛超美，殷坤山，肖 强

(1.中国农业科学院 茶叶研究所， 浙江 杭州 310008； 2.农业部茶叶质量安全控制重点实验室，浙江 杭州 310008)

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(10): 1686-1691

唐美君，郭华伟，葛超美，等. EoNPV对灰茶尺蠖的致病特性及高效毒株筛选[J].浙江农业学报，2017，29(10)： 1686-1691.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.10.13

2017-04-11

国家重点研发计划(2016YFD0200902)；浙江省公益性技术应用研究计划(2014C32095)

唐美君(1972—)，女，江苏丹徒人，推广研究员，主要从事茶树病虫防治技术研究。E-mail: tmjtea@tricaas.com

EoNPV对灰茶尺蠖的致病特性及高效毒株筛选

唐美君1，2，郭华伟1，2，葛超美1，殷坤山1，肖 强1，2

(1.中国农业科学院 茶叶研究所， 浙江 杭州 310008； 2.农业部茶叶质量安全控制重点实验室，浙江 杭州 310008)

茶尺蠖核型多角体病毒(Ectropisobliquanucleopolyhedronviruses，EoNPV)是茶尺蠖的重要天敌。灰茶尺蠖(EctropisgrisescensWarren)是茶尺蠖的近缘种，也是茶树主要害虫。为了探明应用EoNPV防控灰茶尺蠖的效果，发挥其对灰茶尺蠖的生物防治作用，通过生物测定，研究了EoNPV对灰茶尺蠖的致病特性，并进行了高效毒株的筛选。结果表明，EoNPV对灰茶尺蠖1龄幼虫致病力最强，2×104～2×108PIB·mL-1处理对1龄幼虫的致死率达82.7%～100%；对灰茶尺蠖2龄幼虫的LC50值为2.32×106PIB·mL-1(饲毒后9 d)；对不同代别灰茶尺蠖的致病力有明显差别，以第2代为最高。从用灰茶尺蠖连续增殖5代的病毒样品中，筛选出高效毒株QF4，该毒株对灰茶尺蠖致死率比原始毒株提高51.5%，致死中时间缩短1.5 d。研究表明，应用EoNPV防治灰茶尺蠖最适宜在第2代1龄期施用；QF4可作为病毒生产用毒株。

EoNPV；灰茶尺蠖；致病特性；高效毒株；

茶尺蠖核型多角体病毒(Ectropisobliquanucleopolyhedronviruses，EoNPV)自1980年在茶尺蠖(EctropisobliquaProut)上首次发现以来[1]，一直是茶园生物防治研究的重点，其生物学特性[2-5]、制剂研制[6-7]、田间应用技术[8]等方面均得到了深入研究，并逐步实现了商品化，在出口茶和有机茶生产基地得到推广应用，取得了良好的防治效果[9]。但近年来研究发现，EoNPV对茶尺蠖不同地理种群的致病力存在较大差异[10]，对很多地理种群(湖北、湖南、河南、浙江的大部分地区等)的防效不理想，田间病毒致死率仅20%～30%。进一步研究表明，茶尺蠖不同地理种群已分化为2个种，即茶尺蠖(E.obliquaProut)和灰茶尺蠖(E.grisescensWarren)[11]。这两种尺蠖幼虫期外形相像，在生物学特性上也极其相似，肉眼几乎难以区分，过去一直统称为茶尺蠖。迄今为止，EoNPV对灰茶尺蠖的致病性尚未有研究报道。试验表明，灰茶尺蠖也能被茶尺蠖核型多角体病毒感染，但感染后死亡率与茶尺蠖相比存在较大差异。为了明确茶尺蠖核型多角体病毒对灰茶尺蠖的致病特性，提高病毒的防治效果，为田间应用EoNPV防治灰茶尺蠖提供依据，我们测定了不同病毒液浓度、不同虫龄和不同代别下EoNPV对灰茶尺蠖的致病力，并开展了高效毒株筛选的初步研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

灰茶尺蠖幼虫采集于浙江衢州茶园(118.88°E，28.97°N)，茶尺蠖幼虫采集于杭州余杭区茶园(119.90°E，30.39°N)，室内连续饲养2代以上供试。EoNPV为中国农业科学院茶叶研究所实验室保存的EoNPV原液冷藏样品，经室内活体繁殖获得。尺蠖饲养及病毒繁殖提取方法同文献[9]。

1.2 试验方法

1.2.1 生物测定方法

病毒剂量和虫龄试验：EoNPV使用剂量设2×108、2×107、2×106、2×105、2×104PIB·mL-15种处理，分别对灰茶尺蠖1龄、2龄、3龄幼虫进行室内活性测定，以清水处理作对照。

不同代别试验：分别设第1代、第2代、第3代、第4代、第5代5种处理，采用浸叶法以1龄灰茶尺蠖幼虫、2×106PIB·mL-1的病毒使用剂量进行活性测定。不同虫龄和剂量的试验均在(24±0.5)℃恒温人工气候室或恒温培养箱中进行，不同代别试验模拟田间试验，在自然温度下进行。上述各处理均设3次重复，每重复20头虫以上。幼虫开始死亡后，每天记录死虫数。统计计算逐日累计死亡率，并采用DPS分析软件进行差异显著性分析和LC50、LT50计算。

1.2.2 毒株筛选方法

将EoNPV原始毒株稀释成1×107PIB·mL-1的病毒液。从田间采集新鲜茶树嫩梢，将嫩梢在已配好的病毒液中浸湿后晾干备用。取室内大量饲养的2龄灰茶尺蠖幼虫，用带病毒的嫩梢饲养3 d，然后用无病毒的叶片继续饲养。待幼虫开始死亡后，每天将虫尸收集在广口瓶(250 mL)中。经病毒提纯定量后，即获得病毒小样QF1。用QF1重复上述增殖步骤，再次提纯获得的病毒小样即为QF2，以此类推，共获得QF1、QF2、…、QF66个小样。放置在冰箱内冷藏备用。

1.2.3 毒效测定方法

将各病毒样品分别稀释至1×106PIB·mL-1。剪取新鲜干净茶梢，在病毒液中浸湿后自然晾干。剪下带病毒茶梢放入玻璃罐头瓶中，分别接入相应供试种群的2龄幼虫，在(24±0.5)℃条件下饲养。饲毒3 d后，更换无病毒叶片饲养，观察记录死虫数与活虫数。每处理设3次重复，每重复接虫20头以上。统计逐日累计死亡率和LT50。

2 结果与分析

2.1茶尺蠖核型多角体病毒对灰茶尺蠖的致病特性

2.1.1 EoNPV不同使用剂量对不同龄期灰茶尺蠖幼虫的致病力

测定了EoNPV不同使用剂量(2×108、2×107、2×106、2×105、2×104PIB·mL-1)对灰茶尺蠖1～3龄幼虫的致死率，图1显示，使用剂量越大、虫龄越小则幼虫死亡率越高、死亡速率越快。高剂量处理(2×107、2×108PIB·mL-1)对1～3龄幼虫均有较高致死率，致死率在90%以上；2×106PIB·mL-1处理对1、2龄幼虫可达100%致死率，但对3龄幼虫致死率则不到20%；2×104、2×105PIB·mL-1处理对1龄幼虫的致死率可达82.7%～95.4%，对2龄幼虫的致死率下降为29.8%～76.1%，对3龄幼虫则降至3.0%～11.4%(表1)。茶尺蠖核型多角体病毒对灰茶尺蠖的致病力随病毒剂量的增大而增强，并随灰茶尺蠖虫龄的增加而下降。

EoNPV对灰茶尺蠖的致病力呈明显的剂量效应，以图1中2龄幼虫饲毒9 d后的数据计算，EoNPV对灰茶尺蠖2龄幼虫的LC50值为2.32×106PIB·mL-1(95%置信限1.37×106～3.98×106PIB·mL-1)。与EoNPV对茶尺蠖2龄幼虫的LC50值(1.26×103PIB·mL-1)[9]相比，LC50值提高了近2 000倍，说明EoNPV对灰茶尺蠖的致病力低于茶尺蠖。

2.1.2 EoNPV对不同代别灰茶尺蠖幼虫的致病力

分别以灰茶尺蠖第1、2、3、4、5代1龄幼虫为对象，用2×106PIB·mL-1的EoNPV进行活性测定，结果表明，第1、2、5代幼虫期死亡率可达100%，极显著高于第3、4代；幼虫死亡速率以第2代为最快，LT50值(11.8 d)为最小(表2、图2)。不同代别之间死亡率差异的原因主要与气温有关，第3、4代灰茶尺蠖发生于7、8月份，气温较高，而高温对病毒有明显的抑制作用[3，8]。且高温季节灰茶尺蠖生长发育快，尚未发病即化蛹。

图1 不同EoNPV浓度处理对灰茶尺蠖1-3龄幼虫的致死动态Fig.1 Lethal dynamics for 1st-3rd instar of Ectropis grisescens infected with different concentrations of EoNPV

表1不同EoNPV浓度处理对灰茶尺蠖1-3龄幼虫的致死率和LT50

Table1Lethality rate and LT50for 1st-3thinstar ofE.grisescensinfected with different concentrations of EoNPV

EoNPV浓度ConcentrationofEoNPV/(PIB·mL-1)幼虫期死亡率Larvalmortality/%1龄1st2龄2nd3龄3rdLT50/d1龄1st2龄2nd3龄3rd2×108100aA100aA100aA32391072×107100aA100aA900aA39641302×106100aA100aA242bB61105—2×105954aA761bB30cC94145—2×104827bB298cC114cBC129——

同列数据后没有相同小写字母表示差异显著(P<0.05)，没有相同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

The values in the same column followed by different lowercase letters or uppercase letters showed significance at the level of 0.05 or 0.01.

表2不同代别下EoNPV对灰茶尺蠖的防治效果

Table2Control effect of EoNPV on the larvae of different generations ofE.grisescens

代别Generation幼虫期死亡率Larvalmortality/%差异显著性Significance最终死亡率Finalmortality/%差异显著性SignificanceLT50/d相关系数Correlationcoefficent1100A100A136097472100A100A118099173791B963B149096434784B897C160098385100A100A12909185

图2 不同代别灰茶尺蠖感染EoNPV后的死亡动态Fig.2 Lethal dynamics for the larvae of different generations of E. grisescens with the infection of EoNPV

因此，田间应用EoNPV防治灰茶尺蠖以第2代为最佳，其次为第5代和第1代。

2.2茶尺蠖核型多角体病毒高效毒株的筛选

毒株筛选试验结果(表3)表明，QF4毒株的效果最好，12 d内死亡率达100%，致死中时间仅7.7 d，比其他毒株的平均值缩短3.5 d。用QF4毒株分别对灰茶尺蠖和茶尺蠖进行了毒效试验，结果表明，无论对灰茶尺蠖还是茶尺蠖，QF4毒株均比原始毒株EoNPV(CK)的效果好，致死中时间短(表4、表5)。

将筛选出的高效毒株QF4和原始毒株均用灰茶尺蠖进行大量繁殖，获得相应的大量增殖病毒样品，记为QF4(Q)和QV。分别用这两个大量增殖样品对灰茶尺蠖和茶尺蠖进行生测，结果(表6)表明，QF4(Q)对灰茶尺蠖和茶尺蠖的毒效均有提高，QF4(Q)用于防治灰茶尺蠖，不仅死亡速度比对照快，致死中时间缩短1.5 d，而且最终防治效果比对照提高51.5%；用于防治茶尺蠖，QF4(Q)与QV最终防治效果相同，但死亡速度加快，致死中时间缩短1.6 d。

表3EoNPV不同毒株对灰茶尺蠖的毒效测定

Table3The evaluation of the effect of different strains of EoNPV againstE.grisescens

EoNPV毒株EoNPVstrain供试总虫数Totalnumberofinsectstested重复Replication饲毒后不同时间死亡率Mortalityatdifferenttimesafterinoculation/%8d10d12d死亡率(y)对时间(x)的直线回归式Thelinearregressionofmortality(y)versustime(x)相关系数Correlationcoefficent(r)致死中时间Medianlethaltime(LT50)QF1863185513783y=1649x-1165809794101QF285396275519y=1046x-765409922121QF395334299585y=1137x-810709767115QF4843391798100y=1316x-51910995277QF586394291638y=1369x-1066209890114QF695364402674y=1101x-712109305111

表4EoNPV-QF4毒株对灰茶尺蠖的毒效

Table4Effect of EoNPV-QF4strain againstE.grisescens

毒株strain供试总虫数Totalnumberofinsectstested重复Replication饲毒后不同时间死亡率Mortalityatdifferenttimesafterinoculation/%8d10d12d死亡率(y)对时间(x)的直线回归式Thelinearregressionofmortality(y)versustime(x)相关系数Correlationcoefficent(r)致死中时间Medianlethaltime(LT50)QF4963246612890y=160x-10020992294EONPV(CK)105300160y=88x-89309915158

表5EoNPV-QF4毒株对茶尺蠖的毒效

Table5Effect of EoNPV-QF4strain againstE.obliqua

毒株strain供试总虫数Totalnumberofinsectstested重复Replication饲毒后不同时间死亡率Mortalityatdifferenttimesafterinoculation/%4d7d8d死亡率(y)对时间(x)的直线回归式Thelinearregressionofmortality(y)versustime(x)相关系数Correlationcoefficent(r)致死中时间Medianlethaltime(LT50)QF41043225842950y=200x-6460970757EoNPV(CK)107327431758y=211x-10510969074

表6EoNPV-QF4大量增殖样品对灰茶尺蠖和茶尺蠖的毒效

Table6Effect of the mass multiplication sample of EoNPV-QF4strain againstE.grisescensandE.obliqua

3 结论与讨论

昆虫杆状病毒具有很强的宿主专化性。一般来说，一种NPV只能感染一种虫，但也有例外，如AcMNPV(苜蓿银纹夜蛾NPV)可感染苜蓿银纹夜蛾、甜菜夜蛾、小菜蛾、斜纹夜蛾等30多种害虫。过去一直认为，茶尺蠖是EoNPV的唯一宿主，而本研究结果表明，灰茶尺蠖也是EoNPV的宿主之一。灰茶尺蠖田间分布区域广于茶尺蠖[12]，在有些省份两种尺蠖还混合发生，同时这两种尺蠖的幼虫肉眼难以区分。了解EoNPV对灰茶尺蠖的致病特性，筛选应用高效毒株，对灰茶尺蠖和茶尺蠖的生物防治十分有益。本研究首次明确了EoNPV对灰茶尺蠖的致病特性，并筛选出1株高效毒株，研究结果对EoNPV生产与应用有重要的实际意义和参考价值。

根据EoNPV对灰茶尺蠖的致病特性，使用EoNPV防治灰茶尺蠖时应注意病毒的使用浓度、使用虫龄和代别等方面。从本文试验结果来看，田间应用时应着重在低龄期(1龄期)施用，第2代防治为最佳。这与EoNPV防治茶尺蠖的研究结果[8]相似，但是防治期有所提前，防治龄期更小。本研究初步筛选出了1个高效毒株，但其高效的机制尚不清楚，是否是病毒的致病基因发生了变化还有待深入研究。

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PathogeniccharactersofEctropisobliquanucleopolyhedrovirusesonEctropisgrisescensWarrenandscreeningofhighefficientstrain

TANG Meijun1，2， GUO Huawei1，2， GE Chaomei1， YIN Kunshan1， XIAO Qiang1，2

(1.TeaResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310008，China; 2.KeyLaboratoryofTeaQualityandSafetyControl，MinistryofAgriculture，Hangzhou310008，China)

Ectropisobliquanucleopolyhedroviruses (EoNPV) is an effective pathogen ofEctropisobliquaProut larvae.EctropisgrisescensWarren is a related species ofE.obliqua， which is the major pest of tea plant. To investigate the using of EoNPV againstE.grisescens， the pathogenic characters of EoNPV onE.grisescensand screening of high efficient strain were studied. The results showed the 1stinstar larvae ofE.grisescenswas the most sensitive to EoNPV， the mortality was 82.7%-100% infected with EoNPV in the concentration of 2×104-2×108PIB·mL-1. The value of LC50for the 2ndinstar larvae was 2.32×106PIB·mL-1on the 9thday after inoculation. The virulence of EoNPV against the larvae of 2ndgeneration ofE.grisescenswas highest among the 1st-5thgenerations. The strain QF4was screened as high efficient strain through bioassay among all the strains which was extracted from the dead larvae ofE.grisescensinfected by EoNPV constantly. The mortality rate ofE.grisescensinfected by this virus strain increased by 51.5% than that of original strain， and the median lethal time was shortened by 1.5 days. Thus it is suggested that the suitable period of spraying in the field could be at the 1stinstar larvae of 2ndgenerations and the QF4stain could be used to multiply the virus.

EoNPV;Ectropisgrisescens; pathogenic character; high efficient strain

S435.711

A

1004-1524(2017)10-1686-06

（责任编辑张 韵)