高建锋，卢曾奎，马友记，*，李讨讨，赵兴绪

(1.甘肃农业大学 动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070； 2.甘肃肉羊繁育生物技术工程实验室，甘肃 民勤 733300； 3.甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070)

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(10): 1661-1668

高建锋，卢曾奎，马友记，等. 绵羊MUSTN1基因的克隆、序列分析及其组织表达[J].浙江农业学报，2017，29(10)： 1661-1668.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.10.10

2017-04-01

甘肃省科技重大专项计划(1602NKDH020)；甘肃农业大学校级课题(GSAU-ZL-2015-030)；国家肉羊产业技术体系项目(CARS-38)

高建锋(1991—)，女，陕西榆林人，硕士研究生,从事动物遗传育种与繁殖研究。E-mail: 1518867937@qq.com

*通信作者，马友记，E-mail: yjma@gsau.edu.cn

绵羊MUSTN1基因的克隆、序列分析及其组织表达

高建锋1，2，卢曾奎1，2，马友记1，2，*，李讨讨1，2，赵兴绪3

(1.甘肃农业大学 动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070； 2.甘肃肉羊繁育生物技术工程实验室，甘肃 民勤 733300； 3.甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070)

为了探讨绵羊(Ovisaires)MUSTN1基因特征及其在不同发育阶段的背最长肌与股二头肌组织中的表达规律，选取0、2、6、12和24月龄健康绵羊15只，每组3只，采取背最长肌和股二头肌组织，应用分子生物学等方法，对MUSTN1基因CDS区进行克隆，对其进行生物信息学和组织表达分析。结果表明，MUSTN1基因CDS区全序列为248 bp，编码82个氨基酸，其分子量为8.89 ku，等电点为9.93，GC含量大于AT含量，含有5个磷酸化位点、5个N-糖基化位点、1个O-糖基化位点、0个跨膜结构、疏水性蛋白，二级结构主要以无规卷曲为主；与山羊(Caprahircus)该基因核苷酸以及编码氨基酸序列的同源性最高，分别为99.2%、100%，其次为牛(Bostaurus)，分别为97.2%、100%。MUSTN1基因在绵羊不同发育阶段(0、2、6、12和24月龄)的背最长肌与股二头肌中均有表达，在背最长肌中，24月龄MUSTN1表达量最高，极显著高于其他月龄(P<0.01)，0月龄MUSTN1表达量最低，极显著低于2、12月龄(P<0.01)，显著低于6月龄(P<0.05)；而在6月龄绵羊股二头肌中MUSTN1表达量最高且极显著高于其他月龄(P<0.01)，24月龄表达量次之且极显著高于12月龄(P<0.01)，显著高于0月龄(P<0.05)。结论为绵羊MUSTN1基因的编码区序列在物种间具有保守性，且在不同发育阶段的背最长肌和股二头肌组织中均表达，其表达量的高低可能与骨骼肌肉的生长快慢相关。

MUSTN1；绵羊；克隆；组织表达；序列分析

肌肉骨骼胚胎核蛋白1(musculoskeletal temporally activated novel gene，MUSTN1)基因于2004年在小鼠上初次被发现并验证，共编码82个氨基酸[1-2]。该基因启动子区域有6个AP-1转录因子结合位点，试验验证发现，其中一个AP-1转录因子家族成员c-Fos、Fra-2和Jund负责该基因的转录活性，为骨骼肌肉特异性调控的关键因子[3]。因此，我们推测出MUSTN1基因可能是骨骼肌肉特异调控基因。

目前已有相关研究验证了上述推测，如Liu等[4]研究发现MUSTN1基因在正常小鼠骨骼肌和肌腱内优先表达，且如果敲除该基因，就会导致小鼠成肌融合与分化受到抑制。Zheng等[5]研究发现MUSTN1基因能够促进肉鸡蛋鸡骨骼肌生长。Koo等[6]研究发现，MUSTN1基因能够致使美臀羊骨盆、四肢及腰部骨骼肌肉肥大，但也是导致美臀突变的上调基因之一。Liu等[7]应用RNA干扰技术研究了MUSTN1基因在肌原细胞中的功能，发现了沉默该基因后会使肌原细胞内肌纤维生长受阻，且表达水平也明显降低。Kostek等[8-9]研究发现,MUSTN1基因不仅对肌肉损伤修复、软骨细胞的增殖与分化具有一定作用，而且对骨骼肌肉的发育也起到了关键作用。由此可知，MUSTN1基因为肌肉骨骼特异调控基因。截至目前，鼠[10]、猪[11]、鸡[12]、鸭[13]和斑马鱼[14]等物种MUSTN1基因克隆及其组织表达已有相关研究，而绵羊(Ovisaries)作为农牧区主要特种经济动物，有关MUSTN1基因研究尚未见报道。为此，本试验以小尾寒羊为研究对象，克隆MUSTN1基因的 CDS区全序列，并应用qRT-PCR技术对不同发育阶段(0、2、6、12和24月龄)绵羊的背最长肌与股二头肌中MUSTN1表达规律进行分析，为绵羊肌肉发育的调控网络提供实验手段和思路，也可为今后研究羊肉性状的改良提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验选取体质良好的小尾寒羊公羊15只，分别选取0、2、6、12和24月龄共5个时间点(每阶段3只)，按月龄分组，以初生24 h内记为0月龄，同一组月龄与体重相似，均源自甘肃省景泰县三羊养殖公司。试验羊经颈静脉放血处死后，迅速取其背最长肌、股二头肌等组织样品，标记后迅速投于液氮中，置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 绵羊组织总的RNA提取及cDNA的合成

取绵羊背最长肌和股二头肌组织样品迅速转移到灭菌的匀浆器中并将其磨碎，按TransZol UPRNA提取试剂盒(北京全式金生物公司)操作说明提取不同发育阶段肌肉(背最长肌、股二头肌)组织总RNA，用超微量分光光度计(Implen公司，德国)测定浓度及光密度值(optical density，OD)，依据测定结果，筛选出合格的RNA样品，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，选择完整性好的RNA将其浓度调整为500 ng·μL-1。按 Rever-tAid First Strand cDNA Synthesis Kit (北京全式金生物公司)操作说明中的两步法进行cDNA第一链的合成，编号后产物置于-20 ℃保存。

1.3 绵羊MUSTN1基因的克隆

将GenBank数据库中绵羊(Ovisaires，XM_004018390.3)和牛(Bostaurus，NM_001040589.2)MUSTN1基因序列进行比对分析，根据一致性最高的保守序列采用Premier 6.0 和Oligo6.0软件设计引物A1(表1)，以背最长肌组织cDNA为模板，PCR扩增绵羊MUSTN1 CDS区全序列。PCR反应体系25 μL：2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5 μL, cDNA 1 μL(500 ng·μL-1),上、下游引物各0.8 μL, ddH2O 10 μL。反应程序：95 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，64℃ 30 s，72℃ 90 s，40个循环。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，使用紫外凝胶成像仪(Bio-Rad)观察结果。将目的基因片段使用胶回收试剂盒(Omega，USA)回收，与PMD19T(TaKaRa，Japan)载体连接后转化到E.coliDH5α感受态细胞中，经蓝白斑筛选挑取阳性菌落进行菌落PCR扩增，经初步鉴定为阳性克隆的菌液，取1 mL新鲜菌液送上海生工进行序列测定。

1.4 MUSTN1基因的生物信息学分析

利用NCBI的工具ORF Finder(http://www.ncb.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)对获得的CDS序列翻译成氨基酸序列，采用Prot Param 软件预测蛋白基本理化性质；采用Bio edit软件分析基因

全编码区序列中碱基组成并对该蛋白亲疏水性进行分析；采用Signal p4.0软件预测蛋白潜在信号肽剪切位点；采用TMPRED和TMHMM2.0对蛋白跨膜区与螺旋结构进行预测；采用NetPhos2.0、NETOGLYc3.1 和NetNGlyc1.0软件对蛋白潜在磷酸化位点、O-糖基和N-糖基化位点进行分析；应用Protfun软件预测蛋白功能；采用Hopfield软件分析蛋白二级结构，Swiss-modl软件结合PDB数据库综合获得蛋白三级结构；采用 DNAMAN软件分析绵羊MUSTN1基因CDS区序列，氨基酸序列与其他物种的相似性；最后使用MEGA5.0软件构建系统进化树。

1.5 实时荧光定量 PCR

获得绵羊MUSTN1基因完整的CDS区序列后，利用该序列设计实时荧光定量PCR(qPCR)引物，选用β-actin(NM_001009784.2)作为内参基因。采用 Primer Premier 6.0 软件设计荧光定量引物A2和A3(表1)。20 μL反应体系如下：2×TranStart TipGreen qPCR SuperMix 10 μL、A2和A3上下游引物各0.4 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 8.2 μL。扩增程序采用三步法：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，59 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，共45个循环。每个样品重复3次，反应结束后观察扩增曲线和熔解曲线。

1.6 统计分析

根据荧光定量所得到的Ct值，采用2-ΔΔCt方法进行结果处理，运用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析和显著性检验，数据均用平均值±标准误(χ±SE)表示，P<0.01表示差异极显著，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1MUSTN1基因的克隆与序列分析

表1引物序列信息

Table1The information of primer sequence

基因Gene引物序列Primersequence(5′⁃3′)产物长度Productlength/bp退火温度Annealingtemperature/℃MUSTN1A1F：GGGACAGGCAAGCAGACT48164R：CCAAGGTGGCAGGTGAGAA2F：CCACAGCACCCACCATGTCC16059R：TGCTCACATTCCCGCATGACCβ⁃actinA3F：CTTCCAGCCTTCCTTCCTGG18059R：GCCAGGGCAGTGATCTCTTT

以A1为引物进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳检测后发现单一的目标条带，没有拖尾现象，条带大小在481 bp左右(图1)；挑选阳性单克隆菌液进行测序，结果发现编码区无碱基位点突变，通过NCBI在线 PRF Finder软件分析发现，该基因CDS编码区为349～597，共248 bp，其中包含1个起始密码子ATG，共编码82个氨基酸。

2.2 绵羊MUSTN1基因的生物信息学分析

通过在线软件ProtParam分析得到MUSTN1基因分子量为8.893 ku，等电点(pI)为9.93；用Bioedit软件分析MUSTN1基因CDS区全序列(248 bp)，分析发现其4种碱基数分别是60(A)、71(C)、81(G)、37(T)，各占24.10%、28.51%、32.53%、14.86%；采用SignalP4.0软件发现该蛋白C值、S值和Y值均值小于0.5，说明不存在信号肽结构(图2)；采用TMPRED和TMHMM 2.0软件分析，结果显示该蛋白不存在跨膜区域(图3，图4)；采用 NetPhos2.0软件分析该蛋白潜在磷酸化位点，结果表明存在3个苏氨酸(Ser)、2个丝氨酸(Thr)和 0个酪氨酸(Tyr)(图5)；经 NETOGlyc3.1和NetNGlyc1.0 软件分析预测，发现该蛋白潜在O-糖基化位点有3个Ser糖基化位点和2个Thr (图6)，N-糖基化位点有1个(图7)。釆用Bio edit软件对该蛋白的亲疏水性进行分析，表明该蛋白氨基酸残基基本上为疏水(图8)；采用Protfun软件预测了该蛋白的功能，表明该蛋白具有复制和转录、脂肪酸代谢、调节功能、翻译等功能的可能性分别为1.213、1.265、1.316、4.555，说明该蛋白主要在翻译中发挥重要作用；通过 Hopfield软件分析可知，该蛋白二级结构(图9)中α螺旋(Alpha helix)(Hh)为25.61%，β折叠(extended strand)(Ee)为3.66%，无规卷曲(random coil)(Cc)为70.73%，可预测该蛋白二级结主要以无规卷曲为主；利用Swiss-model软件和PDB数据库综合预测MUSTN1蛋白三级结构，获得了最佳模板(图10)。

M， DNA Marker DL2000；1～3， 引物MUSTN1 A1的PCR产物(481 bp)M， DNA Marker DL2000；1-3， PCR products of MUSTN1 (481 bp)图1 绵羊MUSTN1基因PCR产物的电泳图谱Fig.1 Electrophoresis results of MUSTN1 gene PCR product

图2 MUSTN1蛋白信号肽分析Fig.2 MUSTN1 protein signal peptide analyses

图3 MUSTN1蛋白跨膜区结果Fig.3 Prediction of transmembrane regions of MUSTN1 protein

图4 MUSTN1蛋白跨膜螺旋结构预测图Fig.4 Prediction graphic of MUSTN1 protein transmembrane helices

图5 MUSTN1蛋白磷酸化位点分析Fig.5 MUSTN1 protein phosphorylation site analyses

图6 MUSTN1蛋白糖基化位点分析Fig.6 MUSTN1 protein O-glycosylation site analyses

图7 MUSTN1蛋白糖基化位点分析Fig.7 MUSTN1 protein N-glycosylation site analyses

水平线为氨基酸的残基数，垂直线代表相对的亲水区，零点以上为疏水区，零点以下为亲水The horizontal line represents the number of residues of amino acids， and the vertical lines represent the relative hydrophilic regions. The points above the line indicated hydrophobic region， and the point below zero horizontal line was corrsesponded to hydrophobic region图8 MUSTN1蛋白的疏水性Fig.8 The hydrophobicty of MUSTN1 protein

2.3绵羊MUSTN1基因的同源性比较

采用DNAMAN软件将所得绵羊MUSTN1基因核苷酸及编码氨基酸序列分别与表2其他物种进行同源性比较，结果显示，与表2中其他物种相似度分别在70.00%～99.20%，82.93%～100%。同时应用MEGA 6.0软件对表2中物种的氨基酸序列构建系统进化树(图 11)，发现其与山羊亲缘关系最近，其次为牛。

c， 无规则卷曲;h， 螺旋; e， 延伸片段c, represents random coil; h, represents Alpha helix; e, represents extended strand图9 绵羊MUSTN1 蛋白二级结构分析Fig.9 The analysis of secondary structure of sheep MUSTN1 protein

图10 MUSTN1蛋白三级结构模型Fig.10 Tertiary structure of MUSTN1 protein

2.4不同月龄下绵羊肌肉中MUSTN1 mRNA表达

应用荧光定量PCR技术对不同月龄(0、2、6、12、24月龄)绵羊背最长肌与股二头肌中MUSTN1基因表达量进行检测(图12)。结果显示，MUSTN1 mRNA在不同月龄的背最长肌与股二头肌中均表达，在背最长肌中，MUSTN1基因在24月龄中表达量达到最高，与其他4个月龄相比差异性均达到极显著水平(P<0.01)，2、12月龄的表达量极显著高于0月龄(P<0.01)，且2与12月龄之间差异性不显著(P>0.05)，6月龄与0月龄之间差异性显著(P<0.05)，在股二头肌中，MUSTN1基因表达量在6月龄最高，且表达量极显著高于其他4个月龄(P<0.01)，24月龄极显著高于12月龄(P<0.01)，显著高于0月龄(P<0.05)，且0月龄与12月龄之间差异不显著(P>0.05)，2与0、12、24月龄表达基本处于相对平稳水平(P>0.05)。

表2绵羊MUSTN1核苷酸与氨基酸序列与其他物种的相似性比较

Table2Comparison of the similarity ofMUSTN1 nucleotide and amino acid sequence of sheep and other species

种名SpeciesGenBank登录号GenBankNo．核苷酸相似度/%Nucleotidesimilarity氨基酸相似度/%Aminoacidsimilarity山羊(Caprahircus)XM＿018067100199210000牛(Bostaurus)NM＿001040589297210000人(Homosapiens)NM＿20585339029512小鼠(Musmusculus)NM＿18139038448902鸡(Gallusgallus)NM＿21358027008293

图11 六个物种MUSTN1蛋白系统进化树Fig.11 Phylogenetic tree constructed for MUSTN1 protein of 6 species

同一组织不同月龄的不同大写字母分别代表差异极显著(P<0.01)，不同小写字母代表差异显著(P<0.05)Different capital letters represent extremely significant difference (P<0.01)， different lowercase letters represent significant difference (P<0.05) at different months in the same tissue图12 绵羊MUSTN1在背最长肌、股二头肌不同发育阶段中的mRNA水平Fig.12 Relative expression level of sheep MUSTN1 gene in longissimus dorsi and biceps femoris at different months

3 讨论

应用分子克隆技术获得绵羊MUSTN1基因完整CDS区序列，全长248 bp，编码82个氨基酸，而 Han等[11]在研究猪时发现，该基因编码区全长为237 bp，编码78个氨基酸；徐铁山[12]、李娟等[13]也在研究禽类(鸭、鸡)中发现，该基因CDS区全长222 bp，编码78个氨基酸，这种差别揭示了不同物种间遗传距离的远近。同时李娟等[13]还指出鸡MUSTN1蛋白与小鼠、牛、人和绵羊的同源氨基酸相似度高达75%以上，而本研究中绵羊MUSTN1蛋白同样与山羊、牛、小鼠和人的同源氨基酸相似度也高达80%以上，由此表明MUSTN1在物种间具有保守性。

尽管目前有关MUSTN1基因发育过程中的表达研究较少，其表达模式也不一致，如 Xu等[14]研究发现，北京鸭MUSTN1基因在2、4、6周龄胸肌中表达量逐渐增加，在6周龄达到峰值，而在8周龄又有所下降；而在腿肌组织中，MUSTN1基因表达量从出生后1周到3周升高，而且至9周均持续降低。Li等[15]研究发现，鸡MUSTN1基因在不同日龄胸肌与腿肌组织中，其表达趋势为下降—上升—下降，且0日龄表达量最高，同时还比较了相同日龄的胸肌与腿肌组织，胸肌1～28日龄表达量下降，腿肌1～28日龄为上升，说明MUSTN1基因在不同发育期肌肉组织中的差异性表达可能与动物肌肉生长速度快慢和组织特异性相关，而动物肌肉生长速度的快慢又受营养[17]、遗传[18]、性别[19]以及子宫内环境[20]影响。因此，结合本研究分析发现，MUSTN1基因在绵羊背最长肌与股二头肌中，0月龄表达量较低，可能由于在胎儿的肌发生间，由于营养供应不足、营养分配不均匀和子宫内容积限制而使肌发育受阻；0～2月龄表达量持续上升，可能是由于绵羊断奶前(60 d左右)营养物质的摄入较多，可促进肌肉的发育；在 2～6月龄，背最长肌MUSTN1表达量处于下降趋势，可能由于断奶后，初次摄食不适应而导致消化不良、腹泻造成营养物质供应不足，在这样的情况下，由于骨骼肌在营养分配上不具有优先性，进而影响肌肉的发育；6～24月龄背最长肌MUSTN1表达趋势又有所上升，表明此时营养物质充足且营养分配均匀，促进了骨骼肌肉的发育。而在股二头肌中，MUSTN1表达量在2～6月龄处于上升趋势，6～12月龄处于下降趋势，与背最长肌中该基因的表达相反，其原因可能是由于组织与发育特异性表达所致。

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Cloning，sequenceanalysisandtissueexpressionofMUSTN1geneinsheep(Ovisaires)

GAO Jianfeng1，2，LU Zengkui1，2，MA Youji1，2，*，LI Taotao1，2，ZHAO Xingxu3

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China；2.GansuEngineeringLaboratoryofSheepBreedingBiotechnology，Minqin733300，China；3.CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China)

In order to studyMUSTN1 gene characteristics of sheep (Ovisaires) and its expression at different developmental stages inlongissimusdorsiandbicepsfemoris， fifteen sheep longissimus dorsi and biceps femoris tissues were collected at 0， 2， 6， 12 and 24 month old stages (three replicates for each). With application of molecular biology and other methods， the bioinformatics and tissue expression of the coding region ofMUSTN1 gene were cloned and analyzed. The results showed that the CDS region of theMUSTN1 gene was 248 bp， encoded with 82 amino acid， molecular weight of 8.89 ku， its theoretical isoelectric point is 9.93， the GC content is greater than AT content， 5 phosphorylation sites， 5 N-glycosylation site， 1 O-glycosylation site， 0 transmembrane structure， hydrophobic protein and the secondary structure of MUSTN1 protein is dominated by random coil; the highest homology was 99.2% and 100% in the nucleotide and the amino acid sequence of goat (Caprahircus)， followed byBostaurus(97.2% and 100%， respectively).MUSTN1 gene was expressed in thelongissimusdorsiandbicepsfemorisat different developmental stages (0， 2， 6， 12 and 24 month old). The expression ofMUSTN1 in thelongissimusdorsiwas the highest at 24 month-old， which was significantly higher than those at other month old (P<0.01). The expression ofMUSTN1 was the lowest at 0 month and significantly lower than that in 2 and 12 month old (P<0.01)， significantly lower than that in 6 month old (P<0.05). The expression ofMUSTN1 in 6 month old sheep biceps femoris was the highest and significantly higher than other month old (P<0.01). The expression level of 24 month old was significantly higher than that in 12 month old (P<0.01) and 0 month old (P<0.05). The conclusion was that the coding sequence of theMUSTN1 gene of sheep was conserved among species and expressed in the sheep of the dorsal long muscle and biceps femoris muscle at different development stages. The expression level ofMUSTN1 gene may be related to the growth of skeletal muscle.

MUSTN1; sheep (Ovisaries); cloning; tissue expression; sequence analysis

S826

A

1004-1524(2017)10-1661-08

（责任编辑张 韵)