黄礼兵，邹 蓉，朱明慧，周玉弟，郑 曼

NADPH氧化酶抑制剂Apocynin预防脂多糖心肌纤维化的研究

黄礼兵，邹 蓉，朱明慧，周玉弟，郑 曼

目的探讨NADPH氧化酶抑制剂Apocynin对脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)心肌纤维化的预防作用。方法40只小鼠随机分成4组：对照组(CON)、Apocynin组、LPS组和LPS+Apocynin组，每组10只。LPS组和LPS+Apocynin组给予LPS 10 mg/kg，每周1次，连续4周；Apocynin组和LPS+Apocynin组给予Apocynin 10 mg/kg，1次/d，连续4周。采用天狼星红染色评估心肌纤维化程度，RT-PCR检测ColⅠa1、ColⅢa1、MMP2、MMP9 mRNA的表达，Western blot检测心肌gp91phox和p67phox的表达，DHE检测心肌活性氧生成。结果小鼠LPS注射4周后出现心肌纤维化。与对照组比较，LPS组心肌间质内弥漫性纤维组织显著增多，胶原容积分数增加，心肌组织中胶原相关因子ColⅠa1、ColⅢa1、MMP2、MMP9 mRNA表达明显增加，心肌gp91phox和p67phox的表达增加，ROS生成增加(P<0.05)。与LPS组比较，Apocynin干预可抑制上述指标的增加(P<0.05)。结论Apocynin能预防LPS诱导小鼠心肌纤维化，其效应可能与抑制心肌gp91phox和p67phox过表达有关。

脂多糖；夹竹桃麻素；NADPH 氧化酶；纤维化

0 引言

心肌纤维化(Myocardial fibrosis，MF)是冠心病、高血压病、肥厚性心肌病等多种心脏疾病发展到特定阶段的共同病理改变，是心肌重塑的重要表现之一。高脂膳食、吸烟、消耗性疾病、2 型糖尿病等疾病会产生代谢性的内毒素血症[1]。循环中低剂量的LPS慢性刺激可以刺激心肌胶原纤维过量积聚，引起心肌纤维化，这种纤维化与肾素-血管紧张素系统的激活关系不大[2]。最新的研究表明，小鼠经LPS 反复刺激后，心肌TGF-β和CTGF 并没有发生明显改变，而NADPH氧化酶2 (Nox2)可能参与了LPS刺激心肌成纤维细胞胶原合成[2]。Apocynin又称加拿大麻素或夹竹桃麻素，本研究拟用NADPH 氧化酶抑制剂Apocynin (Apo)干预小鼠，观察其对心肌组织纤维化和相关因子表达的影响，并探讨可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 动物模型及干预方案 C57BL/6雄性小鼠40只，体重25～30 g，由常州卡文斯实验动物中心提供，动物合格证号：201511179。LPS、Apocynin购自美国Sigma Aldrich 公司。LPS诱导小鼠内毒素心肌纤维化模型，按10 mg/kg腹腔注射，每周1次，共4周。将40只C57BL/6小鼠平均分为4组：①CON组：腹腔注射同模型组等体积盐水(0.5 mL)；②Apocynin对照组：腹腔注射Apocynin 10 mg/kg，连续4周；③模型组(LPS组)：每周腹腔注射LPS 10 mg/kg(稀释至0.5 mL) 1次，连续4周；④LPS+Apocynin组：LPS处理前0.5 h腹腔注射Apocynin 10 mg/kg，连续4周，LPS给药同LPS组。

1.2 天狼星红胶原染色 左心室心肌组织先于4%多聚甲醛中固定 24 h，充分水洗取出多聚甲醛后，脱水至蜡，石蜡包埋，将左心室心肌组织切成4 μm薄片，置于经多聚赖氨酸处理的防脱载玻片上，烤片后备用。石蜡切片按照苦味酸-天狼星红胶原染色法染色，采用尼康显微镜照相系统拍照，利用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分析，测量心肌切片的胶原容积分数(CVF=心肌胶原面积/所测视野面积)。

1.3 实时荧光定量PCR检测 釆用RT-PCR方法检测心肌组织中ColⅠa1、ColⅢa1、MMP2、MMP9的mRNA水平。取组织30 mg使RNA充分溶解，提取RNA；取2 μL样品，使用Nanodrop 2000测定RNA浓度和纯度；按照Takara PrimeScript RT reagent kit说明书操作，进行反转录。

1.4 Western blot检测 考马斯亮蓝法总蛋白定量后，以等量进行SDS-PAGE电泳，半干法转膜转至PVDF 膜上，用5%脱脂牛奶于4 ℃冰箱中孵育封闭1 h。与一抗于室温下温孵2 h，无菌PBS漂洗4次后将膜与二抗反应2 h。PVDF 膜用无菌PBS漂洗3次后，显色、曝光、显影，凝胶成像分析系统测定光密度，进行蛋白表达的定量分析。

1.5 活性氧检测 ROS(活性氧，Reactive oxygen species)荧光探针DHE能够透过细胞膜进入细胞内，并被细胞内的ROS氧化，形成氧化乙啶，氧化乙啶掺入染色体DNA中，产生红色荧光。用磷酸盐缓冲盐水工作液(PBS，pH 7.4)将DHE稀释至10 μmol/L，取50 μL检测液滴于组织上，37 ℃湿润环境中避光孵育30 min。孵育结束后，用PBS溶液洗2次，每次5 min。荧光显微镜下选择 N21滤色镜(激发波长480～535 nm，发射波长590～610 nm)观察和拍摄细胞红色发射图像，ROS 阳性细胞在整个核区被染成红色，随机选取3个高倍视野(400×)测定ROS相对荧光强度单位。

2 结果

2.1 Apocynin对LPS心肌纤维化的预防作用 天狼星红染色使心肌间质内胶原纤维呈红色，其余心肌组织呈黄色。结果显示，与正常组相比，LPS组心肌间质内弥漫性纤维组织轻度增多，心室的心肌间质可见较多的红色细纤维，血管周围红色纤维组织较多，胶原面积分数(10.8%)升高(P<0.05)；与LPS组比较，LPS+Apo组胶原面积分数(6.9%)降低(P<0.05)；Apocynin单独给药对纤维化无明显作用(P>0.05)。见图1。

图1 Apocynin预防LPS诱导心肌纤维化

2.2 Apocynin对LPS刺激小鼠心肌ColⅠa1、ColⅢa1、MMP2、MMP9 mRNA 表达水平的影响 实时荧光定量PCR 结果显示，与CON组相比，LPS 刺激时，ColⅠa1、ColⅢa1、MMP2、MMP9 mRNA 表达水平均升高；而Apocynin处理可以显著抑制上述因子水平(P<0.05)。见表1。

2.3 Apocynin对LPS刺激小鼠心肌组织Nox2、p67phox表达的影响 LPS刺激后，Nox2表达上调，小鼠心肌组织中Nox2、p67phox亚基的表达水平升高，而Apocynin可以下调Nox2、p67phox的表达水平，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

表1 Apocynin对LPS刺激小鼠心肌纤维化相关因子表达的影响

注：与CON组比较，*P<0.05；与LPS组比较，#P<0.05

图2 Apocynin对LPS刺激小鼠心肌组织Nox2及p67phox表达的影响

2.4 Apocynin对LPS刺激小鼠心肌组织ROS的抑制作用 NADPH氧化酶是体内活性氧的主要来源。DHE 染色结果显示，CON组小鼠心肌ROS生成量较少，荧光强度较弱。而LPS组ROS生成量明显增加，红色荧光强度显著增强；与LPS组比较，LPS+Apo组ROS产生显著减少(P<0.05)。见图3。

3 讨论

持续存在的慢性炎症会使器官产生持续的应激反应，多种细胞因子和生长因子释放，导致组织结构紊乱和纤维化。研究发现，持续升高的LPS 水平主要存在于2型糖尿病，呼吸系统、胃肠道和泌尿生殖道的慢性感染，代偿心脏衰竭，代谢综合征，肝硬化，酒精性脂肪肝疾病和肝炎等慢性疾病[1]。LPS可以引起单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等多种细胞的免疫应答，诱导活性氧、活性氮、前列腺素和多种细胞因子的瀑布式产生与释放，导致内毒素血症。反复暴露于代谢性内毒素血症可诱导心肌纤维化，并且增加死亡率[1-2]。

图3 Apocynin对LPS刺激小鼠心肌组织ROS的抑制作用

氧化应激是许多器官纤维化的主要原因，在心脏中尤为突出。NADPH 氧化酶(Nox)可产生超氧阴离子(O2-)，能够催化电子从NADPH 转移至游离态的O2；Nox有7个成员，包括Nox1～Nox5、Duox1、Duox2。当细胞受到刺激时，NADPH氧化酶的胞质亚基p67phox向细胞膜转移，并在其他小分子结合蛋白的参与下，与细胞膜亚基结合形成复合体而活化。Nox参与了多种病因引起的心脏纤维化。Johar等[3]发现，野生鼠接受AngⅡ或醛固酮后，纤连蛋白、原骨胶原Ⅰ和CTGF 合成增加，MMP-2和NF-κB活性增强，心肌纤维化明显，而NADPH 氧化酶基因阴性(Nox2-/-)鼠不出现上述反应。Nox4可以激活心肌Akt-mTOR和NF-κB信号通路，促进心肌纤维化和重塑，而Nox2抑制剂则消除AngⅡ引起的心肌纤维化[4]。Apocynin是NADPH氧化酶抑制剂，可以预防LPS急性肺损伤[5]；LPS 刺激心肌可以引起心肌纤维化，伴随着Nox2表达增加。本研究发现，LPS刺激会引起ColⅠa1、ColⅢa1及MMP2、MMP9 mRNA 表达水平升高，而后者可被Apocynin处理所抑制；此外，Apocynin处理可抑制NOX亚基Nox2与p67phox表达。

无论细胞静息还是应激状态下，ROS介导的信号通路均发挥一系列功能[6]。LPS和ROS之间存在相互关系。LPS激活Nox，使巨噬细胞、外周血单核细胞和内皮细胞产生ROS，引起急性肺损伤血管炎症[7-9]。Nox2参与了LPS刺激后小鼠心功能不全，与下游的ERK1/2 及p38MAPK有关[10]。亚临床剂量LPS 刺激产生ROS和氧化应激。活性氧可以通过多种信号通路介导心肌细胞的肥大、凋亡，同时通过灭活NO等导致血管内皮功能的紊乱，进而诱发或加重心肌纤维的发生[11]。本研究对小鼠心肌ROS进行了检测，发现LPS刺激小鼠ROS增加明显，荧光强度明显增强；而Apocynin可以抑制LPS引起的ROS增加，表明Apocynin通过减少ROS生成，抑制心肌纤维化。NADPH 氧化酶介导的氧化应激可能是一个用于预防或治疗脂多糖心肌纤维化的重要靶点[12]。

本研究存在一定的局限性。首先，Lew等[2]研究发现，LPS刺激后，心肌NOX2表达上调，NOX4无明显变化，而Apocynin是非特异性的NADPH氧化酶抑制剂，本研究结果不能肯定是哪种NOX参与LPS纤维化；其次，成纤维细胞在心肌纤维化中发挥重要作用，今后可采用心肌成纤维细胞培养来探讨其中的具体机制。

总之，本研究提示，Apocynin可以预防LPS诱导心肌纤维化，为临床预防和干预炎症性心肌纤维化提供新的靶点和干预手段。

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NADPHoxidaseinhibitor-apocynininpreventingcardiacfibrosisinmiceexposedtosubclinicallipopolysaccharide

HUANG Li-bing,ZOU Rong,ZHU Ming-hui,ZHOU Yu-di,ZHENG Man

(Department of Anesthesiology,Affiliated Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210029,China)

ObjectiveTo investigate the preventive effects of apocynin,an NADPH oxidase inhibitor,on cardiac fibrosis in mice exposed to subclinical lipopolysaccharide.MethodsTotally 40 male C57BL/6J mice were divided randomly into 4 groups:control group,apocynin group,LPS group and LPS+apocynin group.LPS was injected intraperitoneally once a week for 4 weeks to mimic cardiac fibrosis in LPS group and LPS+apocynin group.Apocynin was given in apocynin group and LPS+apocynin group,once a week for 4 weeks.Collagen fraction area of the left ventricle was measured with picrosirius red staining.The cardiac expression of fibrosis-related genes was measured by RT-PCR.The subunits gp91phoxand p67phoxof NADPH oxidase were analyzed by Western blot,ROS production was determined by DHE staining.ResultsThe cardiac fibrosis of mice occurred after 4 weeks.Compared with control group,the interstitial diffuse fibrous tissue in myocardium,the collagen volume fraction,the mRNA expression of LPS-induced activation of fibrosis-related genes ColⅠa1,ColⅢa1,MMP2 and MMP9,the expression gp91phoxand p67phoxand ROS production in LPS group were increased.Compared with LPS group,apocynin decreased the above indexes significantly (P<0.05).ConclusionApocynin can protect against the cardiac fibrosis in mice exposed to subclinical LPS by inhibiting the over-expression of myocardial gp91phoxand p67phox.

Lipopolysaccharide;Apocynin;NADPH oxidase;Fibrosis

2017-03-23

南京中医药大学附属医院麻醉科，南京 210029

10.14053/j.cnki.ppcr.201710004