鄂玲玲 徐文焕 乔朋艳 邢鹤琳 王 兴 冯 琳 吕 燕 王东胜 刘洪臣

·论著·

胰岛素、雌激素和培养时间对新生大鼠下颌骨成骨细胞增殖的影响*

鄂玲玲 徐文焕 乔朋艳 邢鹤琳 王 兴 冯 琳 吕 燕 王东胜 刘洪臣

目的：探讨胰岛素、雌激素和培养时间对体外培养的新生大鼠下颌骨成骨细胞(new born ratmandibular osteoblasts，NRMOBs)增殖的影响。方法：取新生6-7天SD乳鼠下颌骨，原代培养下颌骨成骨细胞，选取生长状态良好的第4代细胞，在糖生理浓度(5.5mM)下与6ug/m L胰岛素(Insulin)和/或10-9mol/L雌激素(E2)共同孵育，于1，3，5，7，9d采用MTT(Methy lthiazol Tetrazolium，MTT)法检测胰岛素和雌激素对体外培养的NRMOBs增殖的影响。结果：所培养的NRMOBs阳性表达波形丝蛋白、骨钙素，角蛋白表达阴性，分泌碱性磷酸酶，形成钙结节。NRMOBs在5.5mM葡萄糖下培养，1d时，雌激素显著抑制细胞增殖；7d，9d时，胰岛素显著促进细胞增殖，5.5mM+Insulin组细胞增殖显著高于5.5mM+E2组；雌激素与胰岛素联合应用对细胞的增殖无影响。结论：在不同的培养时间，胰岛素或雌激素单独应用均影响NRMOBs增殖，胰岛素与雌激素联合应用能调节胰岛素或雌激素单独应用时对NRMOBs增殖的影响。

成骨细胞；胰岛素；雌激素；下颌骨；大鼠

牙周病、糖尿病、骨质疏松症以及衰老等均可以造成牙槽骨吸收、牙周膜与牙槽骨的附着丧失、牙骨质的厚度和结构发生改变[1-6]，这常常会影响患者行种植牙手术以及术后骨结合率。因此，牙槽骨再生以及提高牙种植骨结合率是目前牙科医生研究的热点之一。胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。雌激素是由卵巢分泌的雌性脊椎动物的性激素，具有促进第二性征出现的作用。以胰岛素分泌绝对或相对不足为特征的糖尿病伴随着绝经后雌激素分泌减少为特征的骨质疏松症，影响了骨代谢的最终效应细胞之一的成骨细胞的增殖与分化。研究已证实胰岛素除了调控糖、蛋白质和脂肪的合成代谢外还同时具有生长因子样特性，是体内重要的生长因子之一，对成骨细胞的增值、分化有着重要影响[7]。雌激素属类固醇激素，研究表明雌激素通过直接调节机制、旁分泌机制和细胞凋亡机制对成骨细胞和破骨细胞发挥重要作用[8]，这些成骨细胞胚成起源多是中胚层，而颌骨成骨细胞胚成起源是来自于神经嵴，胰岛素以及雌激素又是怎样影响颌骨成骨细胞的增殖呢？目前，胰岛素和雌激素随着培养时间的延长对颌骨成骨细胞增值的共同作用如何报道较少，为此本实验针对这些体内重要的激素在牙槽骨丧失及颌骨的骨质疏松中的作用，分析胰岛素及雌激素随着培养时间的延长对新生大鼠下颌骨成骨细胞增殖的影响，为这些激素在临床上如何更好的应用在牙槽骨再生、牙种植术骨结合中提供一定的实验基础。

1.材料和方法

1.1 材料与仪器 L-DMEM(GIBCO公司，美国)，胰蛋白酶(Am resco公司，美国)，胎牛血清(Fetal bone serum,FBS,GIBCO公司，美国)，噻唑蓝(Methy lthiazol Tetrazolium MTT、牛血清白蛋白，Sigma公司，美国)，小鼠抗人波形丝蛋白、角蛋白抗体、大鼠抗兔骨钙素抗体(中杉金桥公司，北京)， 4′,6-diam idino-2-pheny lindole(DAPI,Biotium，美国)，罗丹明(TRITC)标记的山羊抗小鼠/兔IgG，(Jackson，美国)，正常山羊血清(中杉金桥公司，北京)，其他相关试剂均为国产分析纯试剂。

水浴振荡器(HZS-HA，哈尔滨东明医疗仪器厂)，温控超速离心机(Eppendorf,德国)，超净工作台(长城空气净化，北京)，ELx800uv酶联免疫检测仪(Bio-Tek，美国)，3111型CO2恒温孵箱(ThermoForma，美国)，细胞培养瓶、细胞培养板(Corning，美国)，DM IL倒置相差显微镜及MPS30曝光系统(Leica，德国)，FV 500全反射激光共聚焦显微镜(Olympus，日本)。

1.2 NRMOBs的原代培养 用酶消组织块培养法[9]培养新生大鼠下颌骨成骨细胞。将SD新生6-7d的乳鼠(解放军总医院动物中心购买，SPF级)置于75%酒精中浸泡5m in，取出下颌骨，剥离肌肉和筋膜，将下颌骨剪成1mm×1mm×1mm的骨片，加0.125%胰酶，在水浴振荡器中37℃、140rpm消化8m in，消化6次后终止，离心收集经酶消化后的组织块，再次剪碎，铺于培养瓶中加含20%胎牛血清L-DMEM在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下放置于恒温孵箱倒置培养，4小时后翻瓶。待细胞爬出长至汇合单层时传代，倒置相差显微镜下观察细胞形态，取第4代细胞用于实验。

1.3 NRMOBs的鉴定 将第4代新生大鼠下颌骨成骨细胞以1×105个细胞/m L接种在盖玻片上，细胞培养3d时弃去培养液，95%酒精固定15m in后，用免疫荧光染色[10]检测波形丝蛋白、角蛋白、骨钙素。方法简述如下：取出细胞爬片，PBS漂洗3×5m in。室温下用0.5%TritonX-100作用10m in，PBS漂洗3×5m in。封闭血清室温孵育20m in后，加一抗波形丝蛋白、角蛋白、骨钙素(1∶100)，PBS代替一抗为空白对照，4℃下过夜，PBS漂洗3×5m in，然后用TRITC标记的二抗(1∶50)室温下作用45m in，PBS漂洗3×5m in，DAPI染核15m in，PBS漂洗3×5m in。用90%的甘油PBS溶液封片，激光共聚焦显微镜下观察、照相。

将第4代NRMOBs以1×105个细胞/m L接种在盖玻片上，细胞培养7d时弃去培养液，95%酒精固定15m in后，用Gomori钙-钴法[9]进行碱性磷酸酶染色。

将第4代NRMOBs以1×105个细胞/m L接种在盖玻片上，细胞培养28d后用95%乙醇固定15m in后，蒸馏水漂洗，加入2%茜素红溶液(用2%酒精配制，PH 8.3)染色5m in，自来水冲洗5次后，封片，显微镜下观察、照相。

1.4 实验分组 为了探讨胰岛素及雌激素对体外培养NRMOBs增殖的影响，本实验共分为4组：5.5mM葡萄糖、5.5mM葡萄糖+6ug/m L胰岛素、5.5mM葡萄糖+10-9mol/L雌激素、5.5mM葡萄糖+6ug/m L胰岛素+10-9mol/L雌激素。

1.5 胰岛素和雌激素对体外培养的NRMOBs增殖实验 取第4代对数生长期细胞，胰蛋白酶消化、离心、重悬后，接种细胞于96孔板中，接种密度为5×104/m L，每孔接种0.2m L。细胞贴壁24h后，换用含0.2%牛血清白蛋白无血清L-DMEM培养液饥饿24h，然后按实验分组加含5%胎牛血清、5.5mM葡萄糖、和/或6ug/m L胰岛素及10-9mol/L雌激素的L-DMEM继续培养，每3d换一次液，第1、3、5、7、9d采用MTT比色法于490nm处测定细胞吸光值，每组设8个样本。

1.6 统计学分析 结果以均值表示，采用SPSS13.0统计软件的三因素方差分析以及单因素方差分析对数据进行统计学分析，当方差齐时采用Bonefrroni法，当方差不齐时采用Talnhane法，P＜0.05为差异具有显著性。

2.结果

2.1 原代细胞及传代细胞的形态学观察 在倒置显微镜下观察，原代培养24h后，经酶消化后的下颌骨组织块已贴壁。3d后，细胞从贴壁的下颌骨碎片爬出，呈三角形或梭形(图1A)。数天后爬出的细胞明显增加，以骨块为中心，向周围呈鳞片样生长，瓶底长满至90%即可传代。传代后的细胞核明显增大，形态多样化，胞浆丰富，向外伸展出生长突，生长突逐渐增多，细胞借突起相互连接，呈重叠生长(图1B)。

2.2 NRMOBs的鉴定 第4代的NRMOBs免疫荧光染色结果发现，培养的细胞胞浆角蛋白表达阴性(图2A)，波形丝蛋白呈阳性反应，染成绿色(图2B)，骨钙素表达阳性(图2C)，DAPI染核成蓝色。ALP染色结果显示，细胞质内有黑色颗粒状物质，有少量分散在细胞周围(图1C)。第4代成骨细胞传代后，细胞汇合时均呈多层重叠生长，细胞呈矮柱形或方形，可在局部聚集成灶，形成钙结节，茜素红染色钙结节被染成橘红色颗粒或块状沉淀(图 1D)。

图1 NRMOBs的培养及鉴定A.原代培养5d的NRMOBs(×100)B.P4 的 NRMOBs(×100)C.P4代NRMOBs组织学染色ALP阳性 (×100)D.P4代NRMOBs钙结节茜素红染色 (×100)

图2 NRMOBs的鉴定A.P4代NRMOBs免疫荧光染色角蛋白表达阴性，DAPI染核成蓝色 (×200)B.P4代NRMOBs免疫荧光染色波形丝蛋白表达阳性，染成红色，DAPI染核成蓝色 (×200)C.P4代NRMOBs免疫荧光染色骨钙素表达阳性，染成红色，DAPI染核成蓝色 (×200)

2.3 胰岛素、雌激素及培养时间对5.5mM葡萄糖培养下的NRMOBs增殖的影响 第四代NRMOBs在含5.5mM、5.5mM+insulin、5.5mM+E2、5.5mM+insulin+E2的完全培养基中培养，于1、3、5、7、9d时进行MTT实验。数据进行三因素方差分析，统计结果发现，因素胰岛素，P=0.003；因素雌激素，P=0.007；因素时间，P=0；因素胰岛素*雌激素的交互作用，P=0.845；因素胰岛素*时间的交互作用，P=0.394；因素雌激素*时间的交互作用，P=0.453；因素胰岛素*雌激素*时间的交互作用，P=0.299。四组细胞随着培养时间的延长，细胞不断增殖，1d时，胰岛素、雌激素、胰岛素与雌激素联合应用均抑制了细胞的增殖，但仅仅雌激素的抑制作用具有显著的意义(P＜0.05)；3、5d时，胰岛素、雌激素、胰岛素与雌激素联合应用开始促进细胞的增殖，与5.5mM组没有了明显的差异；到了7、9d时，与5.5mM组比，胰岛素已显著促进了细胞的增殖(P＜0.05)，同时，5.5mM+insulin组的细胞增殖也显著高于5.5mM+E2组(P＜0.05)。胰岛素和雌激素联合在5个时间点中对细胞的增殖作用与5.5mM组没有差别(图3)。

图3 胰岛素及雌激素对5.5mM葡萄糖培养下的NRMOBs增殖的影响(x± s，n=8)。P＜0.05，*分别与相应时间点5.5mM葡萄糖组比较；分别与相应时间点5.5mM+insulin组比较。

3.讨论

牙槽骨再生常常受到牙周病、系统性疾病以及衰老等的影响，从而影响牙种植体早期骨结合率。胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素，除了调控糖、蛋白质和脂肪的合成代谢外还同时具有生长因子样特性，是体内重要的生长因子之一，对成骨细胞的增值、分化有着重要影响[7]。雌激素是由卵巢分泌的雌性脊椎动物的性激素，具有促进第二性征出现的作用，属类固醇激素，研究表明雌激素通过直接调节机制、旁分泌机制和细胞凋亡机制对成骨细胞和破骨细胞发挥重要作用[8]。下颌骨成骨细胞是来源于颌骨的一种成骨细胞，在牙槽骨再生和重建中起着重要作用，下颌骨成骨细胞表面存在着胰岛素受体和雌激素受体[11,12]，胰岛素和雌激素是如何影响其增值，俩者对其增值的共同作用如何？其确切的机制不清楚，并且缺乏来自细胞学的直接证据。

基于此，本实验将新生大鼠下颌骨成骨细胞置于生理糖浓度5.5mM下培养，加入胰岛素和/或雌激素，观察体外培养的大鼠下颌骨成骨细胞的增殖情况。在5.5mM糖浓度培养下，细胞增殖的数据进行三因素方差分析，统计结果发现，因素胰岛素P=0.003；因素雌激素P=0.007；因素时间P=0；因素胰岛素*雌激素的交互作用P=0.845；因素胰岛素*时间的交互作用P=0.394；因素雌激素*时间的交互作用P=0.453；因素胰岛素*雌激素*时间的交互作用P=0.299。统计学结果可见，NRMOBs在生理糖浓度5.5mM培养下，胰岛素或雌激素或培养时间单独对NRMOBs的增殖均有显著效应，但胰岛素*雌激素、胰岛素*时间、雌激素*时间、胰岛素*雌激素*时间对NRMOBs的增殖均没有交互效应；雌激素在1d时显著抑制了NRMOBs的增殖(P＜0.05)，随着培养时间的延长3-9d时，雌激素对NRMOBs增殖的抑制作用降低，与对照组没有了差别；在1-5d时，胰岛素对NRMOBs的增殖没有影响，到7、9d时开始显著促进细胞的增殖，但胰岛素和雌激素联合应用在5个时间点中对细胞的增殖均没有影响。1d时，雌激素在生理糖浓度下抑制细胞的增殖，随着培养时间的延长，雌激素对细胞增殖无影响，这或许是正常细胞早期时对雌激素的一个急性应激反应。胰岛素早期时对生理糖浓度下NRMOBs的增殖无影响，随着培养时间的延长开始显著促进细胞的增殖，这种促进细胞增殖的能力显著高于雌激素，可见，在生理糖浓度下，胰岛素和雌激素对NRMOBs增殖的影响各不相同，胰岛素随着应用时间的延长促进细胞增殖，雌激素短期时抑制细胞增殖，且两者没有交互效应。

本研究结果证实在生理浓度的葡萄糖下胰岛素促进下颌骨成骨细胞增值，雌激素抑制下颌骨成骨细胞的增值，为俩者在临床上更好的应用于牙槽骨再生以及提高牙种植体骨结合率提供了一些实验依据。在高糖情况下胰岛素以及雌激素随着培养时间的延长又是如何影响下颌骨成骨细胞的增值，俩者共同作用又如何，课题组将进行进一步的研究。

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Effectsof insulin,estrogen and culture time on the proliferation of newborn ratmandibular osteoblasts

E Ling-ling,XUWen-huan,QIAO Peng-yan,XING He-lin,WANG Xing,FENG Lin,LV Yan,WANG Dong-sheng,LIU Hong-chen
(Stomatologic institute,Chinese PLAGeneralHospital,Beijing 100853,China)

Objective:To investigate theeffectof insulin(In),estrogen(E2)and culture timeon the proliferation ofnewborn ratmandibular osteoblasts(NRMOBs).M ethods:The NRMOBs were cultured in vitro.The effect of insulin(6ug/m L)and/or estrogen(10-9mol/L)and/or culture time on NRMOBswas investigated.The NRMOBs proliferation was examined after1、3、5、7、9 daysof culture using Methylthiazol Tetrazolium(MTT).Results:The NRMOBs positively expressed vimentin and osteocalcin,negatively expressed keratin,secreted alkaline phosphatase(ALP),and produced calcium nodules.When NRMOBswere cultured in themediaw ith 5.5mM glucose,estrogen significantly decreased the cells proliferation at 1 day of culture,insulin significantly increased the cells proliferation at 7,9 day of culture.Compared to 5.5mM+E2,5.5mM+Insulin significantly increased NRMOBs proliferation at 7,9 day of culture.The combination of insulin and estrogen had no effecton the proliferation of NRMOBsatevery time point.Conclusion:This study suggests that insulin or estrogen alone affects NRMOBs proliferation in different culture time.The combination of insulin and estrogen can adjust the effectof insulin orestrogen alone on NRMOBs proliferation.

osteoblasts;insulin;estrogen;mandibular;rat

R783

A

1672-2973(2017)05-0257-05

国家自然科学基金(项目编号：81271180)解放军总医院临床科研扶持基金(项目编号：2016FC-CXYY-2007；2015FC-CXYY-1003)

鄂玲玲 解放军总医院口腔医学研究所 副研究员 北京 100853

徐文焕 共同第一作者 解放军总医院医务部训练(研究生)处 助理员 北京 100853

乔朋艳 解放军总医院口腔医学研究所 博士后 北京 100853

邢鹤琳 解放军总医院口腔医学研究所 博士后 北京 100853

王 兴 解放军总医院口腔医学研究所 博士后 北京 100853

冯 琳 解放军总医院口腔医学研究所 博士后 北京 100853

吕 燕 解放军总医院口腔医学研究所 实验员 北京 100853

王东胜 解放军总医院口腔医学研究所 副主任技师 北京 100853

刘洪臣 通讯作者 解放军总医院口腔医学研究所 所长 主任医师 教授 北京 100853

2017-06-10)