王晓燕 张建华 刘玉英 尉玉杰 王俊超 董焕声*

仔猪腹泻大肠杆菌菌种保存的研究

王晓燕①①张建华①刘玉英①尉玉杰①王俊超①董焕声*①

（①青岛农业大学动物科技学院 山东 青岛 2661091 ①山东省莱阳市畜牧兽医局）

本文研究了4株仔猪腹泻大肠杆菌菌株不同代次培养的菌液，制成甘油菌后，保存在-20 6℃个月，分析细菌的菌落形态、菌落特征、生化特性、血清血特性、毒力、免疫原性均符合《中华人民共和国兽药典》规定标准；4批冻干保存的菌种，经过36个月的保存后，分析细菌的菌落形态、菌落特征、生化特性、血清血特性、毒力、免疫原性均符合《中华人民共和国兽药典》规定标准。本文为大肠杆菌病的致病机理及疾病的潜伏期提供了理论依据。

仔猪 大肠杆菌 保存

仔猪大肠杆菌病是由大肠杆菌引起的一种急性高度致死性传染病。本病最常发生于初生7日龄以内的哺乳仔猪，因哺乳仔猪下痢，机体迅速脱水，导致全身衰弱而死亡，给养猪业造成严重经济损失。由于仔猪生长期和病原菌血清型的差异，此病可分仔猪黄痢及仔猪白痢两种，猪场传染上该病很难根除。本文针对已经分离得到的大肠杆菌菌株进行保存期的试验，观察大肠杆菌分离冻存后的活性及生化特性。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）甘油菌：C835491、C835492、

C835493、C8354944个批次；C836441、C836442、

C836443、C8364444个批次；C839181、C839182、

C839183、C8391844个批次。冻干菌：C835491、

C835492、C835493、C8354944个批次；C836441、

C836442、C836443、C8364444个批次；C839181、

C839182、C839183、C8391844个批次。（2）试验动物：小白鼠、仔猪。（3）发酵管：葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、靛基质、枸橼酸7种，购于杭州天和微生物制剂有限公司。

1.2 方法 试验菌液分别抽样，加入20%的甘油，分装若干小瓶，2ml/瓶，-20℃冰箱冻结，保存1、3、6、12个月。冻干菌种-20℃冰箱冻结，保存1、3、6、12、24、36个月。定期将被试验的菌种取出检测。取出的菌种检测方法：将菌种划线接种到Minca培养基上，37℃培养20h，观察菌落特征，挑单菌落进行革兰氏染色，观察菌体的形态。将生长好的单一菌落无污染的挑到7种发酵管中

37℃培养12h，完成吲哚试验；M.R.试验；VP试验试验；H2S试验。血清学特性检测：用相对应的因子血清和培养的细菌作玻板凝集试验，观察玻板凝集试验的结果[1-2]。毒力测定：将3种血清型致病性大肠杆菌应用营养肉汤繁殖12h，进行细菌计数，再用无菌生理盐水进行稀释，以麦氏比浊法进行细菌计数，调节浓度至约3×106cfu/ml，采用30日龄ICR小鼠(体重约26g)随机分成2组，以灌胃的方法对实验组动物进行接种，0.2ml/鼠，对照组注射灭菌生理盐水0.2ml/鼠，实验组小鼠均于24h开始出现精神委靡，饮、食欲下降，打堆，大部分小鼠尿色变深[3]；死亡多发生于接种后36～72h。对照组未见异常。对死亡小鼠进行剖检发现，所有死亡小鼠的腹腔内均有浆液性渗出；脾脏坏死；肝脏边缘坏死，肺脏无明显病变；肠道充满黄色液体，部分小鼠的肠系膜出现水肿[3-4]。死亡率为87%。从各组死亡小鼠的十二指肠采样接种麦康凯培养基，均能分离到大肠杆菌。

2 试验结果与分析

2.1 甘油保存菌种 在-20℃冰箱保存1、3、6、12个月的大肠杆菌甘油菌，经过再次培养，完全符合大肠杆菌的菌落形态、菌落特征，菌落光滑圆整，菌种生化特性鉴定如表1所示。

表1 保存1～12个月再培养的菌种生化特性

用相对应的因子血清，做玻板凝集试验，结果：各保存期再次培养的菌种，均能凝集相对应的因子血清，完全符合大肠杆菌的血清学特性。毒力检测结果：试验组小鼠均于24h开始出现精神委靡，饮、食欲下降，打堆，大部分小鼠尿色变深；死亡多发生于接种后36～72h。从各组死亡小鼠的十二指肠采样接种麦康凯培养基，均能分离到大肠杆菌。免疫原性结果：按本规程制成疫苗，达到成品的质量标准。

2.2 冻干菌种 在-20℃冰箱保存1、3、6、12、24、36个月的冻干菌种，经过再次培养，完全符合大肠杆菌的菌落形态、菌落特征，菌落光滑圆整，菌种生化特性鉴定如表2所示。

表2 保存1～36个月再培养的菌种生化特性

用相对应的因子血清，做玻板凝集试验，结果：各保存期再次培养的菌种，均能凝集相对应的因子血清，完全符合大肠杆菌的血清学特性。

3 结论

仔猪腹泻大肠杆菌3个菌株的4个不同代次培养的菌液制备的4批甘油菌在-20℃保存6个月，细菌的菌落形态、菌落特征、生化特性、血清血特性、毒力、免疫原性均符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》规定标准；4批冻干保存的菌种，在-20℃冰箱中保存，经过36个月，细菌的菌落形态、菌落特征、生化特性、血清血特性、毒力、免疫原性均符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》规定标准。

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1007-1733(2017)10-0006-02

2017–06–09）