* 传坤

1.云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南 大理 671000； 2.中国西南药用昆虫及蛛形类资源开发利用协同创新中心，云南 大理 671000； 3.药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心，云南 大理 671000； 4.上海华汇拓医药科技有限公司，上海 201203；5.云南民族大学，云南 昆明 650504

改良Lowry法测定不同产地凹纹胡蜂药材蛋白质含量

杨志斌1,2,3翟宝祺2,4杨红1,2,3刘衡1,2,3李成功1,2,3张艳1,2,3许忻2,4*许传坤1,3,5*

1.云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南 大理 671000； 2.中国西南药用昆虫及蛛形类资源开发利用协同创新中心，云南 大理 671000； 3.药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心，云南 大理 671000； 4.上海华汇拓医药科技有限公司，上海 201203；5.云南民族大学，云南 昆明 650504

目的建立凹纹胡蜂药材中蛋白质含量测定的方法。方法采用改良Lowry法测定标准小牛血清蛋白(BSA)和凹纹胡蜂药材中的蛋白质含量并对其进行方法学考察。结果该方法线性及相关度良好，线性范围较宽，精密度、稳定性、重复性和加样回收率较佳；用该方法分别对不同产地的3批凹纹胡蜂药材中蛋白质含量进行测定，蛋白质含量分别为：德宏州(批号：20150630)12.37%，保山市(批号：20150927)13.08%，曲靖市(批号：20151112)9.63%，药材含水量经测定依次为6.12%、9.92%、10.17%。结论不同产地凹纹胡蜂药材中蛋白质含量有一定差异，采自曲靖市的样品蛋白质含量偏低；实验采用的改良Lowry法测定结果准确、简便、稳定，适用于凹纹胡蜂药材中蛋白含量的测定。

凹纹胡蜂；改良Lowry法；蛋白质；含量测定；方法学研究

昆虫是一种种类繁多、数量庞大、极具开发潜力的自然资源[1]。胡蜂作为重要的昆虫资源之一，因其幼虫含有丰富的蛋白质和人体必须的氨基酸[2]，成虫具有治疗风湿性关节炎和心脑血管疾病的活性成分[3-4]，近年来越来越多的学者开始关注胡蜂的开发潜力，对其营养成分及食用价值、常微量元素等进行了研究[5-7]，拟通过规范化的养殖达到胡蜂药品和食品的开发利用[8]。凹纹胡蜂(VespavelutinaaurariaSmith)是胡蜂科胡蜂属昆虫，主要分布于我国云南、广西、四川、西藏等地区，云南民间常将其蜂巢、蜂毒等入药，以防治风湿病和关节炎等疾病，蜂蛹则是傣族、景颇族等少数民族的传统美食[9]。研究表明[10]，蛋白质是胡蜂的主要营养成分及药效组分，但国内外未见有凹纹胡蜂蛋白质测定的相关报道，因此笔者以云南地区的凹纹胡蜂为研究对象，使用经改良的Lowry法对其进行蛋白质含量的测定，为凹纹胡蜂入药及药材质量研究与开发提供理论基础。

1 材料与仪器

1.1 药材 凹纹胡蜂鲜品采集于云南省德宏傣族景颇族自治州(批号：20150630)；云南省保山市(批号：20150927)；云南省曲靖市(批号：20151112)共三批。样品经中国科学院昆明动物研究所董大志研究员鉴定为胡蜂科胡蜂属凹纹胡蜂VespavelutinaaurariaSmith。将鲜品置于-20℃冻死，再经40℃干燥12h即得干品。

1.2 仪器 T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；BSA124S型分析天平(Sartorius，德国赛多利斯)；Exceed-Ca型超纯水机(台湾艾柯)；YUEXIN101AS-2型电热鼓风干燥箱(上海浦东荣丰科学仪器有限公司)；恒温水浴锅(江苏国胜实验仪器厂)。

1.3 试剂 Folin酚试剂(上海如吉生物科技发展有限公司，批号：151104)；标准小牛血清蛋白(BSA，北京索莱宝生物科技有限公司，批号：112012)；其他试剂均为分析纯；水为去离子水。

2 实验方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 对照品溶液的配制 精密称定标准小牛血清蛋白20.0mg，置于100mL量瓶中，加水溶解，定容至刻度，摇匀，即得0.2mg/mL的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 分别精密称取三批凹纹胡蜂药材粉末(每批3份)1.0g，置于100mL圆底烧瓶中，精密移取25mL水加入到样品中，称定重量，静置1h后回流提取1h，冷却至室温后补足至原重，过滤，取续滤液即为供试品溶液。

2.2 标准曲线的绘制 采用改良Lowry法[11]对标准品溶液进行测定，方法如下：精密吸取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别加水补足至1.0mL，使终浓度为0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20mg/mL。再精密加入碱性铜试剂1.0mL，摇匀，于室温放置10min，再精密移取4.0 mL的Folin酚试剂稀释液(1→8)依次加入其中并立即混匀后于55℃水浴10min，取出后再冷水浴10min，于650nm波长处测定吸光度值；同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度(mg/mL)与其对应的吸光度值(A)计算线性回归方程。标准曲线方程、线性范围及相关系数见表1。

表1 标准曲线方程、线性范围及相关系数

2.3 精密度试验 精密吸取1.0mL的对照品溶液(0.2mg/mL)。按照标准曲线项下方法测定吸光度值，连续测定6次。结果表明，对照品吸光度值RSD为0.18%，表明仪器精密度良好。

2.4 稳定性试验 精密称取云南省曲靖市(批号：20151112)的凹纹胡蜂药材适量，依法制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液20μL，加水补足至1.0mL，按标准曲线项下方法分别于0、1、2、4、16、24h测定吸光度值。结果表明，供试品溶液吸光度值的RSD为0.31%，表明其在24h内基本稳定。

2.5 重复性试验 精密称取云南省曲靖市(批号：20151112)的凹纹胡蜂药材6份，每份约1.0g，依法制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液20μL，加水补足至1.0mL，再按标准曲线项下方法测定吸光度值，并计算含量。结果测得蛋白质含量的平均值为10.06%，RSD为1.46%，表明方法的重复性良好。

2.6 加样回收试验 分别取云南省曲靖市(批号：20151112)的凹纹胡蜂药材6份，每份约0.5g，精密称定，按表2精密称定并加入BSA对照品，依法制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液20μL，加水补足至1.0mL，再按照标准曲线项下方法测定吸光度值，并计算回收率。结果见表2。

表2 加样回收率试验结果 (n=6)

2.7 样品的水分测定 按《中国药典(2015版)》烘干法测定，见文献[12]。结果如表3所示，测得3批不同产地的凹纹胡蜂药材含水量平均值为8.74%。其中，德宏州、保山市和曲靖市的药材含水量分别为6.12%、9.92%和10.17%。

2.8 样品蛋白质含量的测定 精密吸取供试品溶液20μL，加水补足至1.0mL，再按照标准曲线项下方法测定吸光度值。结果如表3所示，测得3批不同产地的凹纹胡蜂药材蛋白质含量平均值为11.69%。其中，德宏州、保山市和曲靖市的药材蛋白质含量分别为12.37%、13.08%和9.63%。计算公式如下。

蛋白含量(%)=

样品水分/%蛋白质含量/%德宏州(批号：20150630)612±0051237±102保山市(批号：20150927)992±0051308±122曲靖市(批号：20151112)1017±107963±131均值8741169

3 讨论

本文所使用经改良的Lowry法与《中国药典(2015版)》四部中的方法相比，不同点在于原方法加入福林酚试剂混匀后于室温放置30min后再测定，此过程中显色的深度随时间不断加深，须规定统一的反应时间且等待时间较长。而经改良后变为于55℃水浴5min，取出后冷水浴10min再测定，加快了显色反应的时间且颜色深度变化较稳定。该方法具有较宽的线性范围，准确灵敏，稳定性佳，回收率高，重复性好，可作为凹纹胡蜂药材蛋白质含量测定的方法之一。

对3批凹纹胡蜂药材蛋白质含量和水分的测定结果表明，不同产地凹纹胡蜂药材的内在品质还是存在一定的差异，可能与不同地区的气候条件和饲养环境有关系，值得进一步深入的研究。

因国内尚未有统一的凹纹胡蜂药材质量标准，本文的研究结果可为将来药材的质量标准的研究和建立提供参考和依据。

[1]刘辉, 鲁为华. 昆虫资源的开发与利用 [J].饲料与畜牧, 2003(1): 32-33.

[2]王云珍, 董大志, 陆源, 等. 凹纹胡蜂与黑尾胡蜂蛋白氨基酸分析研究 [J].Zoological Research, 1988, 9(2): 140-170.

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[4]巫秀美. 具有抗血栓形成作用的黄胡蜂属昆虫中多肽有效部位 [P].中国: CN103638059A, 2014-03-19.

[5]陈玉惠, 欧晓红. 凹纹胡蜂食用虫态营养成分分析及其利用价值评价 [J].西南林学院学报, 1997, 17(1): 39-42.

[6]杨红, 陈丹, 肖培云, 等. 凹纹胡蜂成虫的重金属及常量、微量元素分析 [J].广州化工, 2016, 11(10): 141-143.

[7]冯颖, 陈晓鸣, 叶寿德, 等. 云南常见食用胡蜂种类及其食用价值 [J].林业科学研究, 2001, 14(5): 578-581.

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[11]贺建华, 邵纯君, 鹿麟, 等. 福林酚法测定甘露聚糖肽口服溶液中蛋白质的含量 [J].中国药物评价, 2017,(2): 92-94.

[12]国家药典委员会. 中华人民共和国药典(四部) [M].北京:中国医药科技出版社, 2015: 103-105.

StudyonAnImprovedLowryMethodforDetectingtheContentofProteininVespavelutinaaurariaSmith

YAHG Zhibin1,2,3ZHAI Baoqi2,4YANG Hong1,2,3LIU Heng1,2,3LI Chenggong1,2,3ZHANG Yan1,2,3XU Xin2,4*XU Chuankun1,3,5*

1. Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D, Dali University, Dali 671000, China; 2. Yunnan Provincial 2011 Collaborative Innovation Center for Entomoceutics, Dali University, Dali 671000, China; 3. The National-local Joint Engineering Laboratory for Entomoceutics, Dali 671000, China; 4. Shanghai Synergy Pharmaceutical Sciences Co.,LTD, Shanghai 201203, China; 5. Yunnan Minzu University, Kunming 650504, China

ObjectiveTo establish a method for the content determination of protein inVespavelutinaaurariaSmith.MethodsThe concentrations of bovine serum albumin ( BSA ) andV.velutinaaurariawasdetermined by the modified Lowry method, and to carry out methodological study.ResultsThis method had good correlation linearity, wide linear range and good precision, stability, repeatability and recoveries.ConclusionThe modified Lowry method to determine the protein concentration ofV.velutinaaurariais accurate, simple and stability, it's suitable for protein content determination ofV.velutinaauraria.

VespavelutinaaurariaSmith；Modified Lowry Method；Proteins；Content Determination；Methodology

R29

A

1007-8517(2017)18-0026-03

2017-08-20 编辑：穆丽华)

国家自然科学基金(81660605；81260676)；药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心创新能力建设项目(云发改高技[2015]395)；云南省昆虫生物医药研发重点实验室专项经费(2015DG030)；云南省2011协同创新中心项目([2012]25)；云南省应用基础研究重点项目(2014FA007)。

杨志斌(1986-)，男，白族，硕士研究生，研究实习员，研究方向为昆虫药物质基础及药效。E-mail:79204431@163.com

许传坤(1977-)，男，汉族，博士研究生，高级工程师，研究方向为天然药物研究与开发。E-mail：chkxu@163.com

许忻(1974-),男，汉族，博士研究生，高级工程师，研究方向为药效物质基础。E-mail:xuxin@huahaipharm.com