李冬梅+赵超艺+刘小飞

摘 要 以海南三七根茎芽基部为外植体，对根茎芽基部进行初代诱导、继代增殖、生根壮苗培养，并对其组培苗移栽基质进行筛选，建立海南三七根茎芽基部的组培快繁技术体系。结果表明：根茎芽基部最佳诱导培养基为MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉胶粉10.0 g/L+10%椰汁；继代增殖比较合适的培养基为MS+6-BA 3.0～8.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉胶粉10.0 g/L+10%椰汁；生根最佳的培养基为MS+ NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉胶粉10.0 g/L+10%香蕉泥+活性碳1.0 g/L；组培苗移栽合适的基质为进口泥炭、红壤和腐叶土的混合基质或纯进口泥炭。

关键词 海南三七 ；山奈属 ；基部 ；根茎 ；组织培养

中图分类号 S567.23+6 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.09.007

Rapid Propagation of Kaempferia rotunda via Basal Part of Rhizome Buds

LI Dongmei ZHAO Chaoyi LIU Xiaofei

（Environmental Horticulture Research Institute，

Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou， Guangdong 510640）

Abstract The basal part of rhizome buds of Kaempferia rotunda were used as explants which were induced into calli， subcultured for proliferation and rooted to produce rooted strong plants， and their mediums for tissue culture and transplanting were screened to establish a rapid propagation system for K. rotunda. The results showed that the inducing medium MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3% sucrose + cara rubber powder 10.0 g/L+10% coconut milk was optimum for the basal parts of rhizome buds. The optimum subculture medium for proliferation was MS+6-BA 3.0-8.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3% sucrose + cara rubber powder 10.0 g/L+10% coconut milk. The optimum rooting medium was MS+NAA 0.10 mg/L+3% sucrose + cara rubber powder 10.0 g/L+10% mashed banana + activated carbon 1.0 g/L. The optimum transplanting substrate included red soil， humus soil and imported peat， or pure imported peat.

Keywords Kaempferia rotunda ； Kaempferia ； base ； rhizome ； propagation

姜科（Zingiberaceae）植物可通过种子有性繁殖和切分根茎营养繁殖[1]。然而，有些种类是自交不亲和的，有些是多倍体，均不能结种子，只能通过根茎繁殖[1]。切分根茎分株时，不要分得太小，一般不要少于3～4颗，太少会导致生长缓慢或死亡，同时需要带有新生的块茎，新分开的块茎需去掉所有茎、叶，以减少水分的流失[1]。有些属的植物可以通过茎杆扦插来繁殖，如闭鞘姜属、舞花姜属、姜花属、姜属的部分种类，将成熟的茎杆切成带3～4个节的茎段，直立插入沙土中2节深，或将茎段平放，用沙土稍微覆盖，保持湿润和遮荫，一段时间后，其节上的芽就会萌蘖形成小植株，稍大后分离栽培[1]。

海南三七（Kaempferia rotunda）属于姜科山奈属（Kaempferia）植物，分布于广东、广西、云南、台湾及亚洲南部至东南部[2]，其叶丛生，叶片长椭圆形，叶面淡绿色，具暗绿色斑纹，不耐霜冻，冬季地上部分枯死；花先于叶直接从根茎抽出，头状花序具4～6朵花（白色），唇瓣较大（紫红色），花期3～4个月；根茎有消肿止痛的功效。观叶类，株形好，叶漂亮，花晶莹美丽，在夏秋季节可作为观赏价值高的室内观叶植物[1-4]。由于海南三七不结果，所以不能进行有性繁殖，而且它也没有茎杆，因此，只能采用上述的切分根茎进行营养繁殖。因为母本量不足，切分根茎分株繁殖速度有限，而且对母株的损伤也很大，短期内得不到大量植株。

近年来，不少科研工作者对海南三七的挥发性成分、保育、花粉发育、传粉、组培快繁等方面进行了研究，并取得了较大进展[5-10]。刘盼盼[9]研究表明，海南三七最佳的外植体为组培苗的幼芽或茎尖，将其接种于MS+6-BA 3.0 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L的培養基中，20 d左右有愈伤组织产生，30 d左右有绒毛状根生成；但研究也发现，接种到2种培养基MS+6-BA 2.0/3.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L上诱导，均只有10%被诱导成苗。吴丹[10]研究表明，海南三七无菌苗的假茎基部在暗培养条件下能够获得高质量的愈伤组织，最佳生长调节剂组合为6-BA 2.0 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L，但从外植体诱导出愈伤到分化成苗就需时110 d，周期长，每块愈伤分化成2.38～3.75棵苗。为了建立更优良的海南三七组培快繁体系，本研究以海南三七的根茎芽基部为外植体，进行了丛生芽诱导、继代增殖、生根培养和组培苗移栽等系列研究，建立了高效稳定的海南三七组培扩繁体系，为海南三七种苗的工厂化生产奠定基础。endprint

1 材料与方法

1.1 材料

用自来水将从野外采集的海南三七根茎清洗干净，剪掉贮藏根和须根后，放入质量浓度0.1%的多菌灵可湿性粉剂溶液中浸泡消毒30 min，然后取出晾干表面水分（图1-A）；再放入经洗净消毒的河沙中恒温发芽，洗净后取其根茎上长出的芽（图1-B）。

1.2 方法

1.2.1 外植体处理

将海南三七的根茎芽用自来水洗净，以质量百分比浓度计，先用0.1%高锰酸钾溶液浸泡根茎芽30 min，再用0.1%的百菌清溶液浸泡根茎30 min；接着在自来水下反复冲洗根茎芽30 min；晾干表面水分后，在超净工作台上，切掉根茎芽上的叶片和茎尖，留约2～3 cm高的根茎芽基部；用棉球蘸取70%酒精擦拭芽基部，最后用0.1%升汞溶液消毒15～18 min，灭菌水冲洗4～5次，切掉距离芽基部两端各约0.3～0.5 cm之外的部分，留约1～2 cm的芽基部，并将芽基部接种到诱导培养基中。

1.2.2 培養条件

培养室各阶段温度为25～30℃，光照强度为2 000～2 300 lx，光照时间控制为14 h/d。

1.2.3 试验培养基配方

（1）初代诱导培养。试验了3种芽诱导培养基：（A1）MS，pH 5.8；（A2）MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉胶粉10.0 g/L+10%椰汁，pH 5.8；（A3）MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉胶粉10.0 g/L+10%椰汁，pH 5.8。60 d后统计接种的外植体启动率和出芽指数，启动率=（启动的外植体数/接种外植体总数）×100%；出芽指数：所有外植体上出芽数的平均数。

（2）继代增殖培养。当初代芽基部丛生芽长至4～7 cm时，切下芽，截取芽基部1.0～1.5 cm接种到增殖培养基中诱导丛生芽。试验了3种增殖培养基：（B1）MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉胶粉10.0 g/L+10%椰汁，pH 5.8；（B2）MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉胶粉10.0 g/L+10%椰汁，pH 5.8；（B3）MS+6-BA 8.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉胶粉10.0 g/L+10%椰汁，pH 5.8。每个处理接种20个芽基部，重复3次，25 d后统计增殖系数，增殖系数=统计的总芽数/接种的总芽数。

（3）生根培养。选择苗高4～6 cm的组培苗接入生根培养基中，每处理各接6瓶，每瓶接6株，重复3次。采用以下3种培养基进行海南三七组培苗的生根培养：（C1）MS+活性碳1.0 g/L，pH 5.8；（C2）MS+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉胶粉10.0 g/L+活性碳1.0 g/L，pH 5.8；（C3）MS+ NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉胶粉10.0 g/L+10%香蕉泥+活性碳1.0 g/L，pH 5.8。分别在20 d后统计生根率和单苗平均根数，生根率=（生根的芽苗数/接种芽苗总数）×100%；单苗平均根数=总的根数/生根的苗数。

1.2.4 组培苗的移栽

当生根培养基上的苗长至5～7 cm时，在温室自然光照下炼苗7～10 d；取出组培苗，洗净根部培养基，用0.1%的百菌清溶液浸泡30 min，移栽到如下基质：（1）红壤；（2）腐叶土∶红壤=1∶1（V∶V）；（3）进口泥炭：红壤=1∶1（V∶V）；（4）进口泥炭∶红壤∶腐叶土=1∶1∶1（V∶V∶V）；（5）进口泥炭。统计成活率和观察长势，成活率=成活的苗数/种的苗数。

1.3 数据分析

采用excel 2016和SPSS16.0软件对试验数据进行统计和方差分析。

2 结果与分析

2.1 海南三七根茎芽基部的初代诱导

从表1可看出，不同的激素种类和浓度对根茎芽基部丛生芽的启动有着明显的影响。其中，在A3培养基上培养时，经约20 d培养，能观察到肉眼可见的绿点（图2-A）；至离体培养60 d左右时，出芽指数达4.60，启动率为98.50%，大部分外植体可以分化出3～5个丛生芽，长势较好，是各处理中的最适培养基（图2-B）。此外，A2处理的启动率和出芽指数也较高，次于A3；A1处理的启动率最低，芽分化得慢，可能是因为没有添加椰汁和外源激素。

2.2 丛生芽增殖培养

不同激素浓度对海南三七根茎芽基部增殖培养的影响见表2。从表2可看出，与B1相比，提高6-BA的浓度，可显著增加丛生芽的增殖系数，其中，在B2培养基上经约25 d培养，增殖系数为5.87，大部分丛生芽基部可分化出5～7个丛生芽，长势好（图2-C）；在B3培养基上经约25 d培养，增殖系数为7.56，大部分丛生芽基部可分化出6～9个丛生芽，长势好；在B1培养基上经约25 d培养，增殖系数为4.69，大部分丛生芽基部可分化出3～5个丛生芽。因此，适合海南三七根茎芽基部增殖培养的6-BA浓度范围为3.0～8.0 mg/L，在此范围内均有较多长势好的丛生芽。

2.3 无菌小苗生根培养

从表3可看出，添加NAA可促进长根，但有黄叶；同时添加NAA和香蕉泥，根和苗均粗壮，而且叶片绿色。因此，海南三七组培苗的生根培养中，宜选用配方C3，即MS+ NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉胶粉10.0 g/L+10%香蕉泥+活性碳1.0 g/L，在此配方中植株粗壮，无菌苗长势最好（图2-D）。

2.4 海南三七组培苗移栽成活情况

将海南三七组培苗根部培养基洗净并消毒（图2-E），分别移栽至5种基质的苗床上，经过1个月的栽培管理，其组培苗成活率高低顺序依次是：进口泥炭（98%）>进口泥炭∶红壤∶腐叶土=1∶1∶1（V∶V∶V）（95%）>进口泥炭∶红壤=1∶1（V∶V）（80%）>腐叶土：红壤=1∶1（V∶V）（75%）>红壤（65%）。5种基质中，在以进口泥炭作为栽培基质的苗床上成活率达98%以上（图2-F）；其次是进口泥炭∶红壤∶腐叶土=1∶1∶1（V∶V∶V）的基质，成活率达95%以上。因此，海南三七组培苗宜选用较疏松且营养成分含量高的基质，如将进口泥炭∶红壤∶腐叶土按一定体积混合，不宜单独选用不透气易板结的基质，如红壤。endprint

3 讨论与结论

本研究发现，海南三七根茎芽基部可诱导丛生芽，诱导结果主要受6-BA和NAA浓度的影响，此外，是否添加附加物椰汁也会对结果产生一定影响。与刘盼盼[9]和吴丹[10]的海南三七组培快繁方式不同的是，本研究不经过愈伤组织阶段，而是直接采用以芽繁芽的方式，区别于上述2种海南三七的组培快繁方式，繁殖系数显著提高，且繁殖周期缩短，短期内可获得大量组培苗。此外，本研究与刘盼盼[9]和吴丹[10]均选用MS为基本培养基，不同的是，本研究在培养基中添加了椰汁，至于椰汁在叢生芽诱导和增殖方面的作用，尚需要做进一步研究。

本研究也发现，不同栽培基质对海南三七组培苗的成活率影响显著。采用进口泥炭作为基质时，成活率最高；其次是进口泥炭∶红壤∶腐叶土=1∶1∶1（V∶V∶V）的混合基质；以红壤为基质的成活率最低。由此可见，海南三七组培苗需要保水、透气、保肥好的基质。红壤易板结和不透气，导致成活率低；腐叶土与红壤混合的基质虽透气，但保肥性差，组培苗成活率略高，但长势不好；进口泥炭中含有保水剂且透气，组培苗长势最好；进口泥炭∶红壤∶腐叶土=1∶1∶1（V∶V∶V）的混合基质，同时具有保水肥和透气的特点。因此，组培苗成活率较高，长势也好。综合经济和实用角度考虑，海南三七组培苗宜选用进口泥炭、红壤和腐叶土的混合基质进行栽培。

综上所述，以海南三七根茎芽基部为外植体进行海南三七的组培快繁，是海南三七可行的组培苗繁殖方式之一，其中最佳诱导培养基为MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉胶粉10.0 g/L+10%椰汁；继代增殖比较合适的培养基为MS+6-BA 3.0～8.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉胶粉10.0 g/L+10%椰汁；最佳生根培养基为MS+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉胶粉10.0 g/L+10%香蕉泥+活性碳1.0 g/L。组培苗移栽合适的基质为进口泥炭、红壤和腐叶土的混合基质或纯进口泥炭。

参考文献

[1] 高江云，夏永梅，黄加元，等. 中国姜科花卉[M]. 北京：科学出版社，2006：128-129.

[2] 吴德邻，陈升振，蔡希陶，等. 中国植物志（第十六卷第二分册）[M]. 北京：科学出版社，1981：42.

[3] 路国辉，王英强. 姜科植物花卉应用现状及开发前景[J]. 北方园艺，2011（10）：82-86.

[4] 吴德邻，刘 念，叶育石. 中国姜科植物资源[M]. 武汉：华中科技大学出版社，2016：107.

[5] 徐世涛，阴耕云，刘劲云，等. 海南三七的挥发性成分研究[J]. 云南大学学报（自然科学版），2012，34（6）：701-704.

[6] 刘 念. 中国姜科植物的多样性和保育[J]. 仲恺农业工程学院学报，2003，16（4）：7-11.

[7] 李冬丽. 姜科三种不同类型花粉发育的组织化学研究[M]. 广州：华南师范大学，2010.

[8] 路国辉，李新亮，武文华，等. 海南三七（姜科）的食源性欺骗传粉[J]. 广西植物，2012，32（1）：33-39.

[9] 刘盼盼. 两种姜科花卉的组培快繁及生长调控研究[D]. 广州：华南师范大学，2013.

[10] 吴 丹. 三种野生姜科花卉组培快繁体系的建立[D]. 广州：华南师范大学，2014.endprint