孟保英 张 青 潘晓兰 丁以群 王元祥 彭 乐

(深圳市儿童医院心血管外科，广东 深圳 518026)

含不同比例自体血冷心脏停搏液对未成熟心肌线粒体结构及术后心功能的影响*

孟保英 张 青 潘晓兰 丁以群 王元祥 彭 乐

(深圳市儿童医院心血管外科，广东 深圳 518026)

目的 探讨含不同比例自体血冷心脏停搏液对体外循环下未成熟心肌线粒体结构及术后心功能的影响。方法 年龄≤1Y,体重≤10 kg,体外循环心脏直视手术患儿220例，随机分成HTK液灌注组(A组，n=20)、改良ST.Tomas液灌注组(B组,n=50)，4∶1含自体血停搏液组(C组,n=50)，1∶1含自体血停搏液组(D组,n=50)，1∶4含自体血停搏液组(E组,n=50)，透视电镜观察心肌线粒体超微结构改变，采用彩色多普勒超声仪及无创心功能检测仪评估术后心功能改变。结果 A组心肌线粒体评分及术后1 h左心室射血分数(LVEF)、CI明显高于其他组(P<0.05)，E组心肌线粒体评分及术后1 h LVEF、CI高于其他三组(P<0.05)，C、D组心肌线粒体评分及术后1h LVEF、CI无统计学差异(P>0.05)。结论 1∶4含自体血心脏停搏液对未成熟心肌保护优于其他含血心脏停搏液。

心脏病/先天性；心脏停搏液；线粒体；心肌；心功能

随着心外科技术不断发展，低体重、小年龄婴幼儿心脏直视手术在临床广泛开展，未成熟心肌保护越来越受到人们的重视。临床上婴幼儿心脏直视手术中使用的心脏停搏液大多为晶体停搏液及含血停搏液，但仍有心肌损伤的情况。近年来，我中心研究证实4∶1含自体血冷心脏停搏液对未成熟心肌保护优于冷血停博液和晶体停搏液，但是仍然存在的心肌损伤，因此本研究拟探讨不同比例含自体血冷心脏停搏液对未成熟心肌线粒体超微结构及术后心功能的影响。

1 资料与方法

1.1临床资料

选取2015年5月到2016年5月在我院收治的非紫绀先天性心脏病患儿220例，均行体外循环心脏直视手术，其中男125例，女95例；年龄7 d～10 M，平均(5.3±0.5)M；体重1.8～10 kg，平均(5.3±0.4)kg。随机分成HTK液灌注组(A组，男12例，女8例)、改良ST.Tomas液灌注组(B组, 男27例，女23例)，4∶1含自体血停搏液组(C组, 男26例，女24例)，1∶1含自体血停搏液组(D组, 男28例，女22例)，1∶4含自体血停搏液组(E组, 男29例，女21例)。术前所有患儿心功能分级无显著性差异(美国纽约学会(NYHA)心功能分级标准[1]分级)。术前无肺炎及其他疾病，肝肾功能正常。

1.2方法

1.2.1体外循环 医院伦理委员会通过，监护人知情同意后实施。同一组医生、麻醉师、体外循环师合作完成。采用STOCKER V人工心肺机、TERUMO膜式氧合器，采用浅低温(30 ℃～33 ℃)，红细胞压积(HCT)0.23～0.28。阻断升主动脉，不同组别分别经主动脉根部灌注相应的心脏停搏液,体外循环中90%患儿未给于超滤。体外循环时间38～117 min，平均(68.2±4.2)min，主动脉阻断10～73 min，平均(34.3±3.9)min。

1.2.2心脏停搏液制备及灌注方法 A组：采用德国克勒化学制药生产的成品HTK，(CUSTODIOL,规格500 ml/瓶)，灌注量30 ml/kg，灌注时间3～5 min,灌注压力60～100 mmHg,只灌注一次。B组：按照改良ST.Tomas液配方配制，灌注量20 ml/kg，灌注时间1～2 min,灌注压力60～100 mmHg,只灌注一次。C组：体外循环开始前，经主动脉根部停跳针快速抽取自体血液，抽血时间约30～50 s，保持动脉收缩压≥40 mmHg，自体血抽取完毕后，经主动脉插管补充血容量以维持循环稳定，按血液：晶体4∶1比例配制4∶1自体血冷心脏停搏液，K+浓度20 mmol/L，将配制的4∶1自体血心脏停搏液浸入冰屑液中，制成4 ℃冷停搏液备用，灌注量30 ml/kg，灌注时间1～3 min,灌注压力40～60 mmHg,每45 min灌注一次。D组：经主动脉根部灌注针抽取自体血，按血液：晶体1∶1比例快速抽取血液，K+浓度20 mmol/L，其余制备及灌注同C组。E组：经主动脉根部按血液∶晶体1∶4比例快速抽取血液，K+浓度20 mmol/L，其余制备及灌注同C组。

1.2.3观察指标及测定方法

1.2.3.1心肌超微结构 体外循环开始前5 min自右心耳取材，主动脉开放后5 min 自右心房切口处取材，分别取大小约1 mm×1 mm×1 mm心肌组织块，用滤纸拭干，迅速置于10%戊二醛磷酸缓冲液中固定，丙酮酸脱水、环氧树脂包埋，超薄切片(50～100 μm)，经3%的醋酸铀—枸橼酸铅染色后，置透射电子显微镜(H7650，日本日立公司)下观察心肌超微结构。观察线粒体形态结构，参照Flameng评分标准对线粒体进行评分[2]：0级：线粒体结构正常，充满颗粒；1级：线粒体结构正常，但颗粒缺乏；2级：线粒体肿胀，基质透明；3级：线粒体嵴分裂，伴基质透明和浓度；4级：线粒体嵴分裂，线粒体内膜和外膜完整性缺失。其中0级为5分，以此类推，4级为1分。

1.2.3.2LVEF及CI测定 入院后第2天清晨及术后1 h、6 h镇静睡眠状态下，采用SIEMENS Acuson Sequoia 512型，探头频率6.0 MHZ，Simpson法测定左心室射血分数LVEF[3]。体外循环结束后1 h、6 h采用无创血流动力学动态监测心脏指数(CI)(采用德国CSM-3000无创血流动力学检测系统监测)。

2 结 果

2.1一般结果

所有组患儿无死亡。室颤发生率、低心排发生率及自动复跳率5组均无差别(P>0.05)，无统计学差异。C组自动复跳时间较其他组短，具有统计学差异(P<0.05)。见表1。

表1 A组、B组复跳率及正性肌力药物依赖性比较

注：与A组比较,aP>0.05；与C组比较,cP<0.05。

2.2心肌透射电镜观察

所有组体外循环前组心肌组织超微结构显示肌膜下大部分心肌肌原纤维大多排列整齐，肌浆网未见增生、扩张，局部线粒体堆积，未见明显异常线粒体；肌间质未见特殊病理改变。主动脉开放5 min后，A组肌节及肌纤维仍清晰，线粒体轻度肿胀，但是仍富含颗粒，无空泡化。B组线粒体明显肿胀，出现明显脱颗粒现象及灶性空泡化，伴基质透明及浓缩，线粒体嵴分裂。E组线粒体轻度肿胀，部分轻度脱颗粒现象。C及D组线粒体出现明显肿胀，部分出现脱颗粒及轻度灶性空泡化，伴基质透明及浓缩。 五组线粒体Flameng评分中A组高于其他四组，B组线粒体评分最低，E组线粒体评分高于C及D组(P<0.05)，C及D组线粒体评分无统计学差异(P>0.05)。五组心肌线粒体Flameng评分，见表2及图1～10。

表2 五组不同时点心肌线粒体Flameng评分比较

注：各组与术前比较,aP<0.05；与A组比较，bP<0.05;与C组比较,cP>0.05。

表3 不同时点各组LVEF比较

注：与A组术前及术后6 h比较，aP>0.05; 与A组术后1 h比较，bP<0.05; 与E组术后1 h比较，eP<0.05;C组与D组术后1 h 比较，cP>0.05;各组术后1 h与术前比较，dP<0.05。

表4 不同时点各组CI比较

注：术后1h各组与A组CI比较，aP<0.05， E组与其他三组CI比较，bP<0.05; D组与C组CI比较，cP>0.05;术后6 h各组与A组比较，dP>0.05。

图1、2 A组体外循环前、后(20KX)

图3、4 B组体外循环前、后(20KX)

图5、6 C组体外循环前、后(20KX)

图7、8 D组体外循环前、后(20KX)

图9、10 E组体外循环前、后(20KX)

2.3不同时点各组LVEF及CI比较

各组术前及术后6 h LVEF比较无统计学差异(P>0.05)。术后1 h各组LEVF较术前均有不同程度下降，其中A及E组LVEF较其他组下降程度小，有统计学差异(P<0.05)，C组及D组LVEF比较无统计学差异(P>0.05)。术后1 h A组及E组CI较其他各组较高，有统计学差异(P<0.05)；C组及D组CI比较无统计学差异(P>0.05)。术后6 h各组CI比较无统计学差异(P>0.05)。(见表3、4)

2.4术后随访

五组均无死亡，术后随访1个月～1年，心脏畸形矫正满意，心功能分级无统计学差异。

3 讨 论

未成熟哺乳动物、新生儿和婴幼儿的心肌称为未成熟心肌[4-5]。随着外科及体外循环技术的不断发展，先天性心脏病的手术治疗逐渐趋于低年龄及极低体重化，因此对于未成熟心肌的保护研究受到广泛关注。未成熟心肌的能量充足、心肌收缩力弱、耗能少、抗氧化及抗氧化基能力强等特点，其心肌功能恢复也较快，这就决定了未成熟心肌保护方法明显不同于传统上的成熟心肌[6]。我中心自2005年采用自体血冷心脏停搏液，已证实其优于晶体液和含血心脏停搏液，但是仍存在心脏直视手术后不同程度的心肌细胞损伤[7-8]。故我们通过调整心脏停搏液中自体血成分比例，探讨其对未成熟心肌保护作用。

HTK液具有以下特点：低钠微钙，使得心脏在较低的钾离子浓度下停搏在舒张期；拥有强大的组氨酸/组氨酸盐缓冲系统，可防止细胞肿胀，避免心肌组织发生细胞内、外的酸中毒；为缺血的心肌提供能量[9-10]。改良ST.Tomas晶体心脏停搏液为仿细胞外高钾停搏液，不能提供氧和营养物质，且缺乏酸碱平衡和胶体的缓冲，反复灌注加重心肌水肿。含自体血停搏液增加胶渗压，而且其中含有大量葡萄糖、游离脂肪酸等，为心肌代谢提供高能量物质，有丰富的缓冲物质，红细胞携带氧，可使心脏停搏于有氧的环境中，心脏停搏期间仍可以进行氧化，利于线粒体形态及功能的保护和ATP的保存[11-12]。而且自体血为术中现配制，其不含库血保存液，避免血细胞破损导致的高钾影响灌注液配制的可能，故自体血配制心脏停搏液优于库血。但是含血停搏液冠状动脉毛细血管堵塞且含有炎性介质和白细胞，亦会导致心肌细胞缺血再灌注损伤，导致线粒体损伤及ATP含量下降。但是含自体血停搏液中不同的血液比例，可以使得停搏液中血细胞比例得到调整，可以使得含血停搏液的优点尽可能发挥，而减轻堵塞毛细血管等缺点。本研究证实HTK组及1∶4含自体血心脏停搏液组心肌线粒体评分较其他组高，术后LVEF及CI 亦较其他组高，且有统计学意义(P<0.05)，充分说明较其他组停搏液利于未成熟心肌细胞保护。但是鉴于HTK液价格昂贵，且灌注后对血液稀释较严重，对临床推广困难，而1∶4自体血冷心脏停搏液价格低廉，易于配制，临床易于推广。

本研究认为1∶4含自体血心脏停搏液对未成熟心肌具有一定保护作用，在婴幼儿心脏直视手术中值得推广和应用。

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Effects of different proportions of autologous blood cardioplegia on mitochondrial structure and postoperative cardiac function in immature myocardium

MENG Bao-ying ZHANG Qing PAN Xiao-lan DING Yi-qun WANG Yuan-xiang PENG Le

(Shenzhen Children's Hospital,Shenzhen 518026,China)

Objective:To observe the effect of cold self-blood cardioplegia with different ratio to the mitochondrial ultrastructure parameters and heart function after opening cardiac operation by cardiopulmonary bypass(CPB). Methods：220 infantile patients with congenital heart disease underwent operation by CPB were randomized into five groups according to the different of cardioplegia solution group: HTK solution group (n=20,A group),ST.Thomas solution group(n=50,B group),cold blood cardioplegia with ratio 4∶1(n=50,C group),cold blood cardioplegia with ratio 1∶1(n=50,D group), cold blood cardioplegia with ratio1∶4(n=50,E group).The hear tissue of right atrial was collected five minutes before CPB and five minutes after aortic declamping. The heart tissue was withdrawn for homogenate.The myocardial ultrastructure were analyzed.LEVF were examined before 1d and after 1 h、6 h of operation.CI were examined after 1 h and 6h of operation.Results：Compared with five groups,the Flameng score of mitochondrial ultrastructure of A and E groups was higher than other groups(P<0.05). The Flameng score of mitochondrial ultrastructure had no significant differen between C and D groups(P>0.05).LVEF and CI of A and E groups afer 1 h of operationwas was higher than other groups(P<0.05).LVEF and CI afer 1h of operation had no significant differen between C and D groups(P>0.05). Conclusion：The cold self-blood cardioplegia with ratio 1∶4 was useful to the immature myocardial profection underwent opening cardiac operation by CPB in infant.

heart disease/congenictal;cardioplegia;Mitochondria;Myocardium;heart function

深圳市科技计划资助项目(项目编号：JCYJ20150403100317074)。

孟保英(1978—)，女，陕西渭南人，主任医师，硕士，主要从事临床体外循环心肌保护工作。

R725.4

A

1004-7115(2017)10-1088-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.10.003

2017-07-16)