不同时间一次有氧运动对小鼠骨骼肌Nrf2与Keap1结合作用的影响

2017-10-22姬卫秀毛雅芸王林佳罗琳张缨

中国运动医学杂志 2017年10期

姬卫秀毛雅芸王林佳罗琳张缨

北京体育大学（北京 100084）

NF-E2相关因子（NF-E2-related factor 2，Nrf2）是细胞氧化应激反应中的关键转录因子，可调节靶基因Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的表达[1，2]。在生理状态下，Nrf2与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Kelchlike ECH-associated protein-1，Keapl）耦联，被锚定于胞浆中，并通过泛素化介导Nrf2蛋白降解[3]。运动产生的活性氧（ROS）可激活Nrf2，使Nrf2与Keapl发生解偶联，并使其从细胞浆转位至细胞核与Maf蛋白形成杂化二聚体[4]，而后与下游抗氧化靶基因DNA上的抗氧化元件（ARE）结合，启动其靶基因的转录[5，6]。

研究发现小鼠在急性运动后骨骼肌和心肌中的Nrf2-ARE结合活性增加[7，8]。年轻男性在急性运动后骨骼肌中Nrf2 mRNA水平也出现升高[9]。Horie等使用电脉冲刺激C2C12细胞模拟急性运动，发现Nrf2的表达增加，且与刺激的强度和持续时间密切相关[10]。我们在前期研究中发现，小鼠一次有氧运动1小时后，骨骼肌Nrf2-ARE结合活性和细胞核内Nrf2蛋白表达量无变化，而一次有氧运动6小时后两者均增加[11]。可见急性有氧运动增强小鼠骨骼肌Nrf2抗氧化信号也依赖于运动的持续时间，但其变化机制并不十分清楚。

因此，本研究在前期研究的基础上，以Nrf2与Ke⁃ap1的结合作用为切入点，进一步探讨不同时间一次有氧运动对小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1结合量、Nrf2和Keap1总蛋白表达量、Nrf2核蛋白表达量以及ROS水平的影响，为运动介导Nrf2影响骨骼肌抗氧化作用的分子机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

健康8周龄C57BL/6J雄性小鼠（购于维通利华公司实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCX-K（京）2009-0004，30只，体重18.37 ± 2.26 g，每笼3～4只，饲养于北京体育大学动物房，动物房温度保持在20～25°C，相对湿度保持在50%～70%，每天光照12 h（7:00～19:00），实验动物均自由进食和饮水。按体重随机分为3组，分别是安静对照组（0 h组）和一次有氧运动3小时组（3 h组）、一次有氧运动6小时组（6 h组），每组10只。

安静对照组正常饲养不做任何处理，运动组小鼠进行跑台运动，跑速为15 m/min（70%VO2max强度），坡度为0。运动时间分别为3小时、6小时。正式运动前进行2天的适应性运动。

1.2 取材

在运动组小鼠运动结束后即刻，所有组小鼠脱颈处死，迅速取两侧腿部骨骼肌（由于小鼠体型小，取腿部所有肌肉），用锡纸包裹标记，投于液氮，后转移至－80°C冰箱备后续之用。

1.3 指标测定

1.3.1 ROS测定

小鼠骨骼肌ROS的测定使用GENMED试剂盒（中国上海杰美基因医药科技有限公司，GMS10016.3），采用高质荧光进行测定。取100 mg组织进行实验，具体操作严格按照试剂盒的说明书进行。

1.3.2 提取蛋白

提取总蛋白，取100 mg组织，加入800 μl含蛋白酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液，超声匀浆，冰上静置30 min，后12000 rpm，4°C离心30 min，取上清溶液即为总蛋白。

提取核蛋白，取100 mg组织，加入800 μl含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液A，超声匀浆，冰上静置10 min，振荡器震荡5 s，再于冰上静置10 min，震荡5 s，然后16000 rpm，4°C离心10 min，弃上清。加入含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液B，振荡器震荡振荡15 s，冰上静置10 min，交替进行，共振荡4次，静置40 min，然后16000 rpm，4°C离心10 min，取上清溶液即为核蛋白。

1.3.3 免疫共沉淀

采用免疫共沉淀法测组织总蛋白中Nrf2/Keap1的结合量。将1 ml蛋白浓度为1 μg/μl总蛋白加入到含20 μl Protein A/G Mix Magnetic Beads（美国 Millipore公司，LSKMAGAG02）的离心管中，4°C摇床2 h，将离心管放到磁力架（美国Millipore公司）上，转移上清；向上清中加入5 μl Keap1抗体（sc-33569，santacruz）（In⁃put中加入Nomal rabbit IgG），4°C摇床过夜；次日加入30 μl Protein A/G Mix Magnetic Beads，室温摇床 2 h，弃上清，PBS清洗3次，加35 μl上样缓冲液洗脱，70°C水浴10 min，转移上清液，重复洗脱第二遍，共吸出上清液70 μl。用Bolt 4%～12%Bis-Tris Plus凝胶（美国life technologies公司）上样30 μl进行电泳。之后采用美国Invitrogen公司的iBlot 2将蛋白从电泳凝胶转移至NC膜上。目的条带标记后用5%的脱脂牛奶或BSA封闭1小时后，加入一抗稀释液Nrf2（ab62352，1:200）于4°C摇床孵育过夜。次日洗脱一抗后加入相应二抗稀释液室温摇床孵育1小时。最后洗脱二抗后加发光液用BIO-RAD凝胶显影仪器进行显影。

1.3.4Western Blot

对提取的组织蛋白（总蛋白和核蛋白）进行BCA蛋白浓度测定（BCA Protein Assay Reagent，美国 Ther⁃mo Scientific公司），根据浓度计算配样，上样量为20μg。采用Bolt 4%～12%Bis-Tris Plus凝胶（美国life technologies公司）和NuPAGE MES SDS电泳缓冲液（美国life technologies公司）进行电泳。之后采用美国Invitrogen公司的iBlot 2将蛋白从电泳凝胶转移至NC膜上。目的条带标记后用5%的脱脂牛奶或BSA封闭1小时后，进行一抗孵育：Nrf2（ab62352，1︰200）、Keap1（sc-33569，1︰500）、总蛋白内参β-actin（sc-47778，1︰1000）、核蛋白内参H1（sc-1999，1︰1500），于4℃摇床孵育过夜。次日洗脱一抗后进行二抗孵育1小时：Nrf2（羊抗兔，中杉金桥，ZB-2301，1︰2000）、Ke⁃ap1（羊抗兔，中杉金桥，ZB-2301，1︰5000）、β-actin（羊抗鼠，中科晨宇，164017，1︰5000）、H1（羊抗鼠，中科晨宇，164017，1︰3000）。最后洗脱二抗后加发光液用BIO-RAD凝胶显影仪器进行显影，用其配套软件进行条带检测与分析。读取灰度值，计算结果，公式如下：

1.4 统计学分析

各实验结果用平均数±标准差表示，采用SPSS17.0软件对实验数据进行统计处理，数据分析方法为单因素方差分析，用P＜0.05和P＜0.01分别表示具有显著性和非常显著性差异。

2 结果

2.1 不同时间一次有氧运动对小鼠骨骼肌活性氧（ROS）水平的影响

由图1可知，与0 h组相比，3 h组小鼠骨骼肌ROS水平略有升高，但无统计学意义；6 h组小鼠骨骼肌ROS水平显著性升高（P＜0.05）。3 h组和6 h组之间无显著差异。

图1 各组小鼠骨骼肌ROS水平的变化

2.2 不同时间一次有氧运动对小鼠骨骼肌Nrf2/Keap/1结合量的影响

由图2可知，一次有氧运动3 h、6 h后小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1结合量与0 h组比均显著降低（P＜0.05），一次有氧运动两组之间没有显著性变化。

图2 各组小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1结合量的变化

2.3 不同时间一次有氧运动对小鼠骨骼肌Nrf2总蛋白、核蛋白表达的影响

由图3可知，与0 h组相比，3 h组和6 h组小鼠骨骼肌Nrf2总蛋白表达出现显著性增加（P＜0.05），而3 h组和6 h组之间无显著差异。6 h组小鼠骨骼肌Nrf2核蛋白表达与0 h、3 h组比均显著增加（P＜0.05）。

图3 各组小鼠骨骼肌Nrf2总蛋白、核蛋白表达量的变化

2.4 不同时间一次有氧运动对小鼠骨骼肌Keap 1总蛋白表达的影响

由图4可知，不同时间一次有氧运动后小鼠骨骼肌Keap1总蛋白表达基本无变化。

图4 各组小鼠骨骼肌Keap1总蛋白表达量的变化

3 讨论

3.1 不同时间一次有氧运动对小鼠骨骼肌ROS、Nrf2/Keap1结合作用和Nrf2总蛋白表达的影响

运动引起的氧化应激，可使骨骼肌产生过多的活性分子ROS。当生成的ROS超出骨骼肌的清除能力时，会造成氧化与抗氧化系统失衡，从而导致细胞损伤[12]。另一方面，ROS作为信号物质，它的浓度升高可激活Nrf2，促进其诱导的抗氧化酶的表达[13-15]。有研究报道，运动除了引起ROS水平升高外，还可引起活性氮（RNS）[16]、一氧化氮（NO）[17]、促炎性物质[18-20]等浓度的升高，同时研究发现这些物质也可激活Nrf2[17，21-23]，进而参与抗氧化反应。在我们研究中发现，一次有氧运动3小时后小鼠骨骼肌ROS水平略有升高，但无统计学意义，这可能与我们选择的一次有氧运动的运动强度不高有关。但在该强度下运动6小时后小鼠骨骼肌ROS水平出现显著升高，说明运动持续时间的延长，增加了骨骼肌ROS的产生。

运动产生的ROS可促进原安静状态下细胞浆中的Nrf2/Keapl复合物产生解偶联作用，生成游离的Nrf2和Keap1[4，13]。已有动物实验表明，持续1小时以下的跑台运动，对Nrf2 mRNA和蛋白表达无显著影响[11，24，25]。我们前期的研究也发现1小时跑台跑运动后Nrf2-ARE结合活性和Nrf2蛋白表达未出现显著性变化[11]。因此，在本研究未对小鼠实施1小时一次有氧运动的观察。在我们的实验中一次有氧运动3小时和6小时后发现，与安静对照组（0 h）相比，小鼠骨骼肌的Nrf2/Ke⁃ap1结合量均出现显著降低，游离Nrf2总蛋白表达显著增加。说明运动应激促进Nrf2/Keapl的解绑作用，除了ROS的激活作用外，可能还有其他物质如RNS等的参与[10，16]，但这仍需要进一步研究证实。

3.2 不同时间一次有氧运动对小鼠骨骼肌Keap 1总蛋白表达的影响

在细胞浆中Nrf2与Keapl发生解偶联作用，使游离Nrf2蛋白表达增多的同时，游离Keapl的量也会发生变化[11，26-28]。但在我们研究中却发现，3小时和6小时的不同时间一次有氧运动后小鼠骨骼肌的游离Keap1蛋白表达并无显著性变化。推测这可能与Baird提出的Ke⁃ap1与Nrf2的相互作用遵循“开放”和“闭合”不同构象的循环方式有关[29]。“开放”构象即为一个Nrf2分子结合一个Keap1分子，而“闭合”构象则为一个Nrf2分子与一个Keap1二聚体结合（两个Keap1分子）。当机体受到氧化应激刺激时，处于安静“开放”构象状态的分子可被诱导呈现为“闭合”状态，从“开放”构象解绑释放出的Keap1分子又可重新结合到“闭合”构象，而游离Keap1的分子数量基本没有发生变化[29]。另外，在我们之前的研究中也发现，四周间歇低氧和低氧训练可改变骨骼肌游离Nrf2的总蛋白表达量，但同时对游离Keap1蛋白表达无影响[30]。

3.3 不同时间一次有氧运动对小鼠骨骼肌Nrf 2转位入核的影响

通常，转录因子激活后，需从细胞浆中转移进入细胞核，识别与结合靶基因启动子上的顺式作用元件（一段DNA序列），进而启动和调控下游基因的mRNA表达。因此，Nrf2作为转录因子，也需进入细胞核与其靶基因上的ARE结合，从而发挥Nrf2的抗氧化转录活性[4]。在我们的研究中发现，小鼠一次有氧运动3小时和6小时后，虽然骨骼肌Nrf2总蛋白表达均显著增加，但其骨骼肌Nrf2核蛋白表达仅在6小时后显著升高，而3h组无显著变化。这说明Nrf2从细胞浆转移入核可能需要一定时间，会有一个延迟效应。但这仍需要进一步的实验验证。