郝永红+王梓如+侯毅鞠

摘 要：单层细胞培养由于细胞是在改变的体外环境下增值生长，因此会丧失原有组织的性状，不利于科学研究。而体外三维培养技术是将细胞、细胞基质放到体外去培养，并且营造与体内相似的内环境，使细胞能够表达合理的基因及性状，有观察直观和条件可控的优点。本文对三维细胞培养技术在诸多生命科学领域的应用，以及对此技术的未来发展做一综述。

关键词：细胞培养；肿瘤治疗；肿瘤血管形成；器官再造

中图分类号：Q943.1 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2017）17-0203-02

单层细胞培养于1885年以来首次从鸡胚中分离出细胞建立体外培养[1]，距今有百年历史，在此期间单层细胞培养技术为医学领域带了新的希望，但随着科技的进步，人类对于健康不断提出更高的要求，虽然人类越来越多的疾病可以被治愈，同时也存在许多有待解决难题，比如器官移植存在的排斥反应、移植器官来源少等问题，在未来能很好解决这一问题的技术即三维细胞培养技术。这一技术的出现，给医学界带来了更大的进步和希望。

1 三维细胞培养技术

三维细胞培养技术（three-dimensional cell culture， TDCC）是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，利用各种方法及材料，使细胞在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞-载体复合物。更接近于体内生长模式，形成类似体内组织的结构，发挥其功能。[2，3]三维细胞培养技术在抗癌药物的筛选、组织形成、血管发育等发育生物学的分支领域得到了广泛的应用。

2 三维细胞培养技术的分类

2.1 基于scaffold的培养体系和无scaffold的培养体系

Scaffold则又有天然成分和人工合成成分之分。基于scaffold的培养体系是没有供细胞粘附、生长和扩散的支撑结构，使培养基中的细胞聚集成为类似于组织的微组织球体（micro tissue spheroids）。无scaffold的培养体系可通过悬滴（hanging drops）让细胞在重力的作用下通过自组装形成微球体。这种方法的优点是可以通过控制悬滴而精准的控制微组织球，使其具有高一致性，为后续研究提供好的微组织材料。而且通过悬滴法可以实现对不同细胞类型的共培养，保证共培养细胞间的信息交流。无scaffold的培养体系天然ECM作为支持材料的3D培养，这种方法以天然ECM作为支持材料，根据培养细胞类型，优化3D培养基质配方，以满足不同组织细胞的培养需求。但天然基质材料存在一定病原风险，且材料可能存在批次差别性等缺点。而人造基质作为支持材料的3D培养方法，合成的人造基质材料类型相当多，可使体外细胞培养更接近体内的生理特征，是基础研究、药物筛选和再生医学等领域的理想选择。

2.2 静止性三维细胞培养和动力性三维细胞培养

静止性三维细胞培养是把细胞直接种植在三维载体上，体外不施加任何物理方法下进行的培养。采用静止细胞培养方法不利于细胞向载体内部生长，培养液很难扩散渗透到载体的中心，氧气、营养物质扩散和代谢物排出受限，从而影响载体内部细胞的代谢活性。因此，需要改善培养条件或细胞种植方法来解决细胞活性降低、数量不足和分布不均匀的问题。动力性三维细胞培养就是根据细胞在自然条件下生长受力情况，在培养过程中适当应用物理方法。动力性三维细胞培养不仅为细胞生长提供了适宜的生物性微环境和力学刺激，而且能更好地促进细胞功能的发挥。由上可见，当前的细胞培养系统的完善，越来越趋向于模拟体内正常的环境。

3 三维细胞培养技术在医学领域的应用

3.1 三维细胞培养技术与肿瘤医学

3.1.1 抗肿瘤治疗

肿瘤是人类的一大顽疾，伴随医学研究技术的不断进步，抗肿瘤药物层出不穷，不断更新，化疗仍是治疗肿瘤的重要手段，在抗癌药物的研发过程中药物筛选极其重要。而三维细胞可以高度模仿肿瘤细胞的生长状态，可以提供肿瘤细胞与体内相似的酸碱度、营养物质、生长因子等内环境，还可以充分展示细胞-细胞、细胞-基质间的相互作用，有利于抗癌药物药效的测定。Ong等[4]在观察三维多细胞肿块球形体药透时，发现细胞外基质蛋白可能是药物渗透的屏障，该现象在体内也常被发现，是肿瘤耐药的较常见原因之一。Hkanson等[5]研究三维模型中环境参数对抗肿瘤药物的影响时，发现细胞间连接、维度（dimensionality）、基质组成的微环境均影响乳腺癌细胞MCF-7对抗肿瘤药紫杉醇的反应，尤其在纤维蛋白为基质培养生长的细胞，药物敏感明显降低，与体内研究发现，纤维蛋白表达上调会增强乳腺肿瘤细胞侵袭和转移相一致。三维细胞培养技术在抗肿瘤治疗领域，较好的弥补了单纯二维培养的不足，成为抗肿瘤治疗的关键。

3.1.2 腫瘤耐药机制研究

肿瘤细胞对抗肿瘤药物产生耐药，是导致肿瘤化疗失败的常见因素。已有研究表明，乳腺癌干细胞会对乳腺癌的发生、转移等产生较大影响。通过模拟肿瘤微环境，可更好地对乳腺癌干细胞增殖与分化情况进行分析。陈峻崧等[6]将普通二维养与卵巢癌肿瘤干细胞维比，探讨符合体内环境的三维培养条件，研究肿瘤生长、耐药等影响因素及机制。结果表明，与二维培养相比，三维培养卵巢癌HO8910细胞系中CD44+CD117+CSCs表现出明显的耐药性，表明BME基质胶三维培养模型可作为靶向治疗肿瘤与细胞药物筛选的理想体外模型。

3.1.3 肿瘤血管形成

肿瘤的生长利于血管新生，利用肿瘤血管生成的研究可以观察肿瘤组织内微血管的形态与功能，阐明肿瘤诱发血管新生的机制及血管生成与肿瘤发生、发展的关系。已经研究证实血管组织再生需要细胞、细胞外基质、信号系统共同参与完成。三维细胞培养技术可使细胞立体生长，在接近体内微环境中，更好的模拟了体内细胞三维的生长环境，并在生长因子的作用下内皮细胞的迁移、增殖、分化，最后出芽形成新的血管网络结构[7]三维肿瘤模型更好地体现了体内肿瘤的生物学特性，并可通过特定的成像系统实现其可透见性，动态追踪细胞的生长乃至发展形成肿瘤的整个过程，因而可对肿瘤浸润和转移过程进行长期动态观察。

3.2 三维细胞培养与骨及软骨的创造

不同来源的骨细胞与不同材料的三维立体结构载体在体外共同培养，构成骨细胞载体复合物的三维细胞培养系统。[8]以此三维细胞培养系统再生出软骨、骨、半月板等骨组织。该系统常在细胞外基质领域运用干细胞研究干细胞发育潜力；在聚合物生长支架领域运用软骨细胞研究细胞分化；在复合组织培育领域运用软骨细胞和上皮细胞研究组织间相互作用；在模拟生物支架领域运用成骨细胞研究生物材料研究；在氧气供应领域利用成骨细胞和内皮细胞研究骨血管化。[9]这一发现为各个领域在体外培养骨及软骨提供依据。

3.3 三维细胞培养与肝脏修复

在一定的培养条件下，肝细胞在基质孔隙中重组形成许多有功能的聚集体，这些聚集体中可能具有接近的细胞-细胞接触[10]，為肝细胞的体外培养提供类似于体内环境的结构，可以表现出比单层贴壁培养的肝细胞更好的生理功能。Schmelzer利用具有独立中空纤维膜系统三维多室生物反应器，培养人原代肝实质和非实质细胞[11]该系统拥有的培养液循环系统可以增加细胞团中心细胞摄入营养和氧气，帮助其排除代谢废物和二氧化碳。结果显示所培养的实质细胞团块内可见复杂的胆管网络和祖细胞样的细胞集落，并检测到血管样结节部位的分裂细胞中含肝细胞生长因子[12]，这一发现为临床上体外培养肝细胞，用于肝脏修复及移植提供依据。

3.4 三维细胞培养与神经系统疾病

三维细胞培养技术在神经系统领域也有涉及，近来有实验培植单一神经元成为多细胞聚集体、海马体活标本切片后测试神经元电势、神经干细胞培养治疗老年痴呆症、帕金森病等。在药物测试中运用神经元细胞聚集体进行毒理实验；在和生物材料的接触效应中运用神经元研究生物材料的体内可降解性；在生长支架中运用神经元和基质研究再生过程；在信号识别中运用神经干细胞研究组织整合；在微质量培养中运用干细胞研究干细胞分化潜力。[13]这一发现为治疗精神疾病及神经系统研究提供宝贵依据。

4 展望

客观来说三维细胞培养技术的诞生是令人瞩目的，在器官再造、器官修复、抗肿瘤药物的筛选等诸多领域取得里广泛的应用，除了这些医学领域，它也可在植物细胞领域中有所发展，以此研发出各种稀有中草药。三维相对于二维细胞培养的优势非常明显，更接近细胞的体内状态；能够提高细胞因子、抗体及其他生物分子等的产量；能够改进细胞培养效率，细胞在三维环境中比在二维环境中生长更健康；实验数据更可靠。但三维细胞培养技术与此同时也存在着许多问题需要改进，例如三维细胞培养的细胞不能永生化，同时分化能力也受到限制，使细胞处于亚佳状态。对于相对复杂的组织结构，单靠三维细胞培养技术是不足够的。因此三维细胞培养技术需要不断完善不断进步，与细胞生物学、发育生物学、分子免疫学、生物材料学等领域相结合，奠定好组织工程学的基础，使其更好的应用于医学领域。

参考文献

[1]VOYTIK- HARBINSL.Three-dimensional extracellular matrix substrates for cell culture[J] .MethodsCellBiol，2001，63：561-581.

[2]滕伟，郭志坤. 细胞三维培养的研究进展[J].医学综述，2008，（12）：1767-1770.

[3]Cell survival in a three-dimensional matrix. ALAVI A，STUPACK D G. Methods in Enzymology.2007.

[4]OngSMZhaoZAroozTetal.Engineeringascaffld-free3Dtumormdelforivtrugpeetratnstdies.Bioaterials，2010，31：1180-1190.

[5]HkansonMTextorCharnleyM.Engineered3Denvironmentstoe-lucidatetheeffectofenvironmentalparametersondrugreponseincancer.IntegrBiol（Camb），2010，11：31-38.

[6]陈峻崧，王净，陈登宇，等.三维培养评价人卵巢HO8910CD44～ +CD117～+CSCs耐药性的研究[C].全国免疫学学术大会，2012.

[7]Arrondeau J，Gan HK，Razak AR，et al. Development of anti-cancer drugs[J].Discov Med，2010，10（53）：355-362.

[8]Demir R，Kayisli UA，Cayli S，et al. Sequential steps during vasculogenesis and angiogenesis in the very early human placenta[J].Placenta，2006，27（6-7）：535-539.

[9]Ogawa R，Oki K，Hyakusoku H. Vascular tissue engineer ingand vascularized 3D tissue regeneration[J].Regen Med，2007，2（5）：831-837.

[10]王颖钰，陆茵，张伟伟，孙志广，郑仕中，陈磊.三维细胞培养技术在肿瘤研究领域的应用[J].中国药理学报，2009，（12）：1545-1548.

[11]唐开，党耕町.三维细胞培养在骨组织工程中的应用[J].中华骨科杂志，2003，（02）：60-62.

[12]程智清，刘景丰. 肝细胞体外三维培养技术进展[J].中国实用医药，2007，（14）：103-105.

[13]赵燕娜，许健，邓同乐.三维细胞培养技术在再生医学研究中的应用[J].科技通报，2011，（04）：531-535.