张艳秋

【摘要】 分析酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测乙型肝炎（乙肝）两对半的检验步骤， 总结检测全程的相关影响因素。检测前标本的准备、试剂盒的影响、检验人员的业务水平、检测过程中的标准操作规程、检测结果的解讀等是ELISA法检测乙肝两对半的相关影响因素。ELISA法是检测乙肝两对半的灵敏方法， 严格遵循操作规程， 加强质量控制， 可有效排除相关影响因素的干扰， 为乙肝的临床诊疗提供有力依据。

【关键词】 乙肝两对半；酶联免疫吸附实验；质量控制

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.28.115

我国的乙肝病毒目前感染率大概占到总人群的60%～

70%， 这其中乙肝表面抗原携带人群占总人口的7%左右， 以此计算， 全国约有9300万人携带乙肝病毒， 其中慢性乙肝患者约2000万例[1-3]。乙肝两对半作为现阶段临床诊断、治疗乙型病毒性肝炎及观察疗效的重要实验室指标， 主要使用ELISA进行检测， 其灵敏度高， 但在其检测过程中影响因素较多， 易导致假阳性或假阴性结果[4]。因此在实际工作中， 临床实验诊断过程中需要加强实验室的科学管理， 不断强化检测的标准流程， 加强实验室诊断的质量控制， 为患者提供准确的检验结果， 有利于疾病的早期诊断和治疗， 同时减少医患纠纷等问题。

1 检测前的质量控制

1. 1 标本的准备 检测前应该保证标本无溶血现象， 因为溶血导致红细胞破裂后会将体内过氧化物酶活性物质释放，这种过氧化物酶活性物质会和显色剂发生显色反应， 影响显色比对；患者血块完全收缩也可能致使待检标本中的非特异性活性物质出现部分或者完全失活的情况发生[1]， 尤其是在血液标本尚没有完全凝固的状态下， 若强行对血清进行分离处理会导致纤维蛋白块形成， 极易导致检测结果的假阳性。此外患者基本信息的核对也是标本准备质量控制中至关重要的一步。

1. 2 试剂盒的影响 选择的试剂盒， 其质量是保证实验诊断结果准确性、特异性的必要前提。但需要临床检验人员注意的是， 目前市场上不同厂家的试剂盒在特异性、准确性、稳定性以及特异性存在一定差异， 因此在实际操作过程中， 要求试剂盒保存在4℃左右的环境下， 并且需在测定前将试剂盒放置于室温进行平衡处理约0.5～1.0 h[5]。此外检测结果也会因方法学不同而有所差异。例如实际工作中常存在用ELISA法检测乙肝表面抗原（HBsAg）结果为阴性， 而电化学发光法检测结果为阳性。除方法学的灵敏度外，还存在使用单克隆或多克隆抗体试剂的差别。单抗对变异抗原或亚型乙肝标志物检测存在一定差异。

1. 3 检验人员的业务水平 检验人员的业务水平对检测结果同样会造成重大影响。实验室检验人员需要掌握并严格执行乙肝两对半检测过程中的室内、室间质量控制方法， 以及失控处理原则。检验人员同时还需要熟悉本实验室实验操作流程， 掌握乙肝两对半各项指标的临床意义[2]， 同时需要学会正确使用加样器和测定仪器等。

2 检测过程中的质量控制

2. 1 加样 加样枪的准确性和吸头清洁与否可以直接影响检测结果， 所以检测过程中必须严格按照操作规程执行加样。加样器需经常清洗， 定期校准。放置温育箱前， 必须使用振荡器将所加样本震荡混匀>30 s[6]。

2. 2 温育 标本加入板孔后， 由于酶标板周围与内部孔升降温速率不同， 抗原抗体结合及酶促反应都容易产生边缘效应， 导致检测孔周边与内部结果出现差异。尤其实验室干育易出现周边效应， 反应板周边孔中间孔温度出现差异， 这会使得检测结果准确性直接受升温速度影响[3]。因此为了使反应孔底部均匀升温， 实际操作过程中常使用水育的方法， 并且尽量保证整版温度快速地达到平衡，以此减少相应的误差。

2. 3 洗板 洗板作为ELISA法操作过程中一个重要环节， 其目的是将未结合的抗原或抗体、酶标记物复合物中分离出来以保留抗原抗体复合物， 同时还能将非特异性吸附的纤维蛋白原、白蛋白、细菌中酶类物质等干扰物除去。检测中每一次均应使用新鲜蒸馏水或去离子水来稀释洗涤剂， 这样可以防止因为洗涤液污染而出现结果误差[7]。此外洗板机针小孔极易由于血清中残留的纤维蛋白或洗涤液析出的结晶导致阻塞， 使得未结合标记酶不能彻底洗脱。所以在使用洗板机过程中需要定时观察、检查洗板机针孔通畅与否， 如出现堵塞时需及时纠正， 洗板机暂停工作时应采用蒸馏水清冼数遍。

2. 4 显色 显色是采用ELISA法测定乙肝两对半过程的最后一个步骤， 其原理是通过适当温育使反应孔内酶标物质催化底物生成有色产物， 以间接判定待测物含量。光线、温度及温育时间等均影响显色效果。通常底物显色在37℃、时间在10～40 min内可以彻底完成[8]， 因为在光照条件下底物液会自行变色， 所以最后的显色反应该在避光状态下进行。

3 检测结果解读的质量控制

在终止液加入后10 min内应完成实验结果判断，以避免反应孔出现结晶反应而影响酶标仪检测结果。临床检验人员需要有极高的责任心和对工作负责的态度，保证检测试剂质量、效期。在整个实验过程中， 外部质控血清需要按照相关规定进行严格管理， 所有复检标本均需详细记录复检原因、时间、结果。

人体血清中含有非特异性干扰物质，在不同程度地影响ELISA检测结果， 如纤维蛋白原、补体、类风湿因子、嗜异性抗体等。此外某些药物也会对结果判读造成一定误差， 如高效价乙肝免疫球蛋白， 这种物质会与HBsAg形成抗原抗体复合物， 导致HBsAg的检出误差[9]。

4 临床意义

①检测结果提示HBsAg阳性， 提示该患者已经感染乙肝病毒，但是这项结果并不反映病毒是否存在复制及病毒复制程度， 也无法提示是否存在传染性。②乙肝病毒表面抗体 （HBsAb）是人体内乙肝中和抗体的标志，其阳性提示患者对乙肝病毒存在抵抗， 可以防御乙肝感染。针对乙肝疫苗接种的检查者，如果仅有HBsAb阳性，应作为乙肝疫苗接种后出现的正常现象。③乙肝病毒e抗原（HBeAg）是人体内乙肝病毒复制的标志， 如果若HBeAg持续阳性>3个月， 则表示疾病可能有慢性化趋势， 应该及时治疗。④乙肝病毒e抗体（HBeAb）是乙肝病毒在体内复制停止的标志检查，表示病毒复制在逐步减少，传染性较弱。⑤乙肝病毒核心抗体（HBcAb），提示检查者曾经感染， 或正在感染乙肝病毒， 免疫球蛋白（Ig）M抗体， 提示患者新近感染或病毒正在复制，在患者感染后体内就会产生，对于乙肝临床诊断的辅助检查有一定意义。

临床经常使用的术语：大三阳， 即：HBsAg、HBeAg、HBcAb出现阳性， 往往提示患者体内乙肝病毒复制活跃、存在一定传染性， 但“大三阳”是否会引起严重肝细胞损害， 还要视肝功能检查、临床体征而定， 诸多研究文献都已经证明“大三阳”并非表示疾病很严重， 只是HBsAg、HBeAg、HBcAb指标阳性体现乙肝病毒在机体内即时的免疫状态[10]。另外一个临床术语：小三阳， 是指HBsAg、HBeAb、HBcAb出现阳性， 当出现“小三阳”时， 还需要结合乙肝病毒复制情况进行分析， 病毒阳性小三阳， 也会对肝细胞进行损伤， 也需要进行治疗[11]。

乙肝是当前严重危害人们身心健康的常见传染病之一， 也是医疗卫生事业的一项难题，血清两对半检测对乙肝的临床诊断、治疗方案选择、康复监测及疗效判定均能起到一定指导作用， 目前乙肝两对半的常用检测方法为 ELISA法[4]。但在检测过程中标本前处理、加样、洗板及显色等都可以影响ELISA法测定结果，如不注意， 极易出现假阳性或假阴性结果， 影响患者疾病诊断和病情进展。因此在实际操作过程中， 检验人员应严格按照操作程序，保证检测系统在控， 以及实验室湿度、温度符合检测要求， 设立阴阳对照及临界值，以严谨、认真、负责的工作态度对待每一份标本，对检测结果存有疑议的标本应予以复查并做详细记录，杜绝假阳性及假阴性结果的产生， 保证检测质量，为患者提供准确的检测结果。

参考文献

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[11] 薛春杨， 周建波. ELISA法乙肝两对半检测影响因素分析和临床意义. 中国误诊学杂志， 2011， 11（16）：3913-3914.

[收稿日期：2017-06-06]