刘媛媛 官秀梅 成敏 李鑫 潘岳阳 郭志良

三磷酸腺苷敏感性钾离子通道在外源性硫化氢抑制高糖诱导的成骨细胞损伤中的作用

刘媛媛1官秀梅2成敏2李鑫2潘岳阳2郭志良3

1.潍坊医学院口腔医学院，潍坊医学院附属医院口腔科；2.潍坊医学院临床医学院；3.解放军89医院骨科，潍坊 261053

目的 研究三磷酸腺苷敏感性钾离子通道（KATP）在硫化氢（H2S）抑制高糖（HG）诱导的成骨细胞损伤中的作用。方法 原代培养大鼠下颌骨成骨细胞并鉴定，将成骨细胞给予HG、H2S、KATP通道开放剂吡拉地尔（Pia）、阻断剂格列本脲（Gli）处理后，用Western blot检测KATP通道蛋白的表达水平，同时采用CCK8、实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、茜素红S染色分析方法检测其对成骨细胞增殖、分化及矿化的影响。结果 细胞KATP通道蛋白的表达水平在HG的影响下明显降低，H2S预处理明显抑制HG对KATP通道蛋白的下调作用和对成骨细胞增殖的影响，并防止HG引起的成骨细胞分化和矿化的减少；相反，KATP通道阻断剂能明显阻断H2S对成骨细胞的上述保护作用。结论 H2S通过KATP通道抑制了HG诱导的成骨细胞损伤。

硫化氢； 高糖； 成骨细胞； 三磷酸腺苷敏感性钾离子通道

糖尿病所致的全身代谢性骨病，如骨量减少及骨质疏松在颌骨也有类似表现，表现为颌骨的骨质疏松和牙槽骨丧失，导致患者较高的失牙率，严重影响口腔健康。硫化氢（H2S）是继一氧化氮和一氧化碳之后的气体信号分子家族新成员，体内的组织、器官，如脑、心血管、骨组织等均能产生内源性的H2S。随着对内源性H2S在各个系统及组织内的重要作用及其病理生理机制不断研究，人们开始考虑使用外源性H2S或其供体，在控制一些疾病的发生及发展中发挥其积极作用，有研究[1]报道外源性H2S对高糖（high glucose，HG）引起的心肌细胞损伤中有抑制作用，其抑制作用由H2S生物学效应靶分子三磷酸腺苷敏感性钾离子通道（adenosine triphosphatesensitive potassium channel，KATP）通道介导；H2S通过提高成骨细胞的活性促进骨折的愈合[2]。本研究旨在探讨外源性H2S是否对HG诱导的成骨细胞有保护作用，以及H2S是否通过激活KATP通道调节成骨细胞的功能，以期为H2S对成骨细胞的作用机制做进一步的阐明，为H2S治疗糖尿病所致的骨质疏松提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及主要试剂

SD大鼠6周龄，雌雄不限，体重120～180 g（解放军89医院实验动物中心）；硫氢化钠（NaHS，H2S供体）、格列本脲（glibenclamide，Gli）标准品、吡拉地尔（pinacidil，Pia）标准品、茜素红S（Sigma公司，美国），实时逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）技术相关试剂（大连宝生物工程有限公司），CCK8试剂盒（Dojindo公司，日本），胎牛血清（杭州四季青生物公司），Trizol（Invitrogen公司，美国），DMEM培养基（Hyclone公司，美国）。

1.2 成骨细胞的分离、培养及鉴定

颈椎脱臼法处死大鼠，75%乙醇浸泡10 min，采用酶消化法-组织块联合培养成骨细胞[3]。在超净台内将大鼠仰卧，用碘伏棉签消毒大鼠口腔，无菌取出带有肌肉和筋膜的下颌骨，置于75%乙醇中洗5～10 s后，在5.25%NaClO中浸泡1 min，用PBS（含200 IU·mL-1青霉素、200 μg·mL-1链霉素）冲洗3次，完全剥离肌肉和筋膜，拔除牙齿，将下颌骨用咬骨钳剪碎成2 mm×2 mm的骨片后，用PBS冲洗骨片，去除残余血液，加0.125%胰酶，在水浴振荡器中37 ℃、140 r·min-1消化8 min。消化6次后终止，收集第2～5次消化液经200目不锈钢筛网过滤并离心，去除上清液后用含10%胎牛血清的DMEM重悬细胞，接种于培养瓶中，于恒温孵箱中静置培养40 min，差速贴壁，纯化成骨细胞后继续培养。经酶消化后剩下的组织块，再次剪碎至1 mm，铺于培养瓶中倒置培养，4 h后翻瓶。待细胞长满80%传代。采用碱性磷酸酶钙钴法染色、细胞矿化结节染色对细胞进行鉴定。取状态良好的第3～5代细胞用于实验。

1.3 实验分组

实验分组如下。1）对照组：DMEM培养基处理成骨细胞30 min；2）HG组：HG（26.5 mmol·L-1）处理[4]30 min；3）NaHS组：NaHS（400 μmol·L-1）处理[1]成骨细胞30 min，撤去，PBS洗2 次，接着DMEM培养基处理30 min；4）NaHS+HG组：NaHS（400 μmol·L-1）作用成骨细胞30 min，撤去，PBS洗2次，接着用HG（26.5 mmol·L-1）处理30 min；5）Gli+NaHS+HG组：Gli（0.01 μmol·L-1）作用[5]成骨细胞30 min，撤去，PBS洗2次，后续实验步骤与NaHS+HG组相同；6）Pia+HG组：Pia（0.1 μmol·L-1）作用[5]成骨细胞30 min，撤去，PBS洗2次，接着HG（26.5 mmol·L-1）处理30 min；7）Gli组：Gli（0.01 μmol·L-1）作用成骨细胞30 min，撤去，PBS洗2次，接着DMEM培养基处理30 min；8）Pia组：Pia（0.1 μmol·L-1）作用成骨细胞30 min，撤去，PBS洗2次，接着DMEM培养基处理30 min；9）Pia+NaHS+HG组：Pia（0.1 μmol·L-1）作用成骨细胞30 min，撤去，PBS洗2次，后续实验步骤与NaHS+HG组相同；10）Gli+HG组：Gli（0.01 μmol·L-1）作用成骨细胞30 min，撤去，PBS洗2次，接着HG（26.5 mmol·L-1）处理30 min。

1.4 Western blot方法检测KATP通道蛋白

将细胞放置于6孔板中培养，待细胞长至80%左右，按对照组、HG、NaHS+HG、NAHS分组，采用PBS清洗3次，加入裂解液，4 ℃静置30 min，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液，然后用BCA法进行蛋白质及定量。总蛋白质及经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分离后，转移到聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。用5%脱脂奶粉封闭60 min，随后分别加入抗KATP SUR1（1∶200）抗体，4 ℃过夜，然后用TBST洗3次，每次5 min，与相应的Ⅱ抗（1∶1 000）室温孵育1.5 h，用TBST洗3次，每次5 min。将PVDF膜用电化学发光显色，暗室曝光到X线片上，凝胶成像系统扫描分析结果，重复5次。

1.5 CCK-8试剂盒检测成骨细胞增殖

向96孔板中均匀加入细胞（每孔密度40个·μL-1），按HG、NaHS、NaHS+HG、Gli、Pia和Gli+NaHS+HG及Pia+NASH+HG分组，加入CCK-8试剂和培养基的混合液，按1∶10比例，在培养箱内孵育2 h，酶标仪测定各孔在450 nm波长的吸光度。

1.6 RT-PCR检测成骨分化标志基因的表达

将成骨细胞接种于6孔板中，细胞生长至融合后无血清培养24 h，按HG、NaHS、NaHS+HG、Gli、Pia和Gli+NaHS+HG及Pia+NASH+HG分组进行干预，24 h后，按Trizol试剂说明书提取总RNA，溶于DEPC处理的去离子水中，-70 ℃保存备用。SYBR Green荧光定量RT-PCR测定各组Ⅰ型胶原蛋白（collagen protein Ⅰ，CollaⅠ）、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、Runt 相关转录因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）基因的表达。引物由大连宝生物设计合成，引物序列见表1。以管家基因磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为内参，以超纯水（PCR级，无RNase）作为阴性对照。按2-ΔΔCt来计算出各组扩增效率。

1.7 成骨细胞矿化分析

细胞接种于12孔板中，按HG、NaHS、NaHS+HG、Gli、Pia和Gli+NaHS+HG组及Pia+NASH+HG分组处理细胞；培养28 d后，进行茜素红S钙染色。培养板用PBS洗2次，95%乙醇原位固定10 min，1%茜素红S（2%乙醇配制，pH8.3）染色5 min，加入50%乙醇去除非特异性着色，空气干燥，每孔选取5个视野拍照后应用Image Pro Plus 6.0专业图像软件分析矿化结节数量和面积。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.8 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件对实验数据进行分析，对各组结果进行方差分析和t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原代成骨细胞的形态学观察和鉴定

细胞经差速贴壁后，培养24 h可贴壁，在倒置显微镜下观察，细胞呈三角形、纺锤形和多角形等多种形态，细胞长满瓶底时，呈梭形或立方形，排列紧密（图1A）。光镜下，碱性磷酸酶钙钴法鉴定成骨细胞可见细胞质内有红棕色颗粒或块状颗粒（图1B）；长期培养，细胞复层生长逐渐形成小结，随着胶原堆积和钙盐沉积，最后形成不透光的矿化结节，经茜素红S染色呈红色块状沉淀（图1C）。

图1 原代成骨细胞的形态和鉴定Fig 1 The morphology and identification of primary osteoblasts

2.2 H2S减弱HG对KATP通道蛋白的抑制作用

免疫印迹分析表明，HG对KATP表达有明显的抑制作用（HG组和对照组相比，P＜0.05）。NaHS+HG组KATP表达明显高于HG组（P＜0.01）。结果表明，KATP通道蛋白的表达量在HG影响下减少，而NaHS减弱HG对KATP的表达抑制（图2）。

图2 H2S减弱HG对KATP通道蛋白表达的抑制Fig 2 H2S ameliorated the inhibitory effect of HG on KATP channel protein expression

2.3 H2S通过KATP通道调节HG抑制的成骨细胞增殖

HG对成骨细胞增殖具有明显抑制作用（对照组和HG组相比，P＜0.01），成骨细胞的增殖在KATP通道阻断剂Gli影响下明显减少（对照组和Gli组相比，P＜0.01）。成骨细胞在HG处理后，加入KATP开放剂Pia，成骨细胞的增殖与HG相比显著增加，差异有统计学意义（Pia+HG组和HG组相比，P＜0.01），Pia+HG和NaHS+HG组比较差异无统计学意义，说明Gli通过阻断KATP通道对成骨细胞增殖的抑制作用与HG对成骨细胞的增殖抑制类似，而NaHS与Pia对成骨细胞的增殖影响作用类似；比较NaHS+HG和HG及Gli+HG+NaHS和NaHS+HG的结果差异有统计学意义（P＜0.01），说明NaHS预处理可以明显影响HG对成骨细胞增殖的抑制，使成骨细胞增殖增加（图3）。

图3 H2S通过KATP通道调节HG诱导的成骨细胞增殖抑制Fig 3 H2S mediated the HG-induced osteoblast proliferation inhibition

2.4 H2S通过KATP调节成骨细胞分化及骨形成相关基因的表达

H2S通过KATP通道促进成骨细胞成骨分化相关基因的表达情况见图4。

图4 H2S通过KATP通道促进成骨细胞成骨分化相关基因的表达Fig 4 H2S promoted the expression of genes associated with osteoblast differentiation through KATP channel protein

与对照组相比，HG明显抑制成骨细胞的CollaⅠ、OPN、Runx2和BMP基因表达（P＜0.01）。NaHS+HG处理对CollaⅠ的表达影响不显著，但是HG对Runx2、BMP及OPN的抑制作用被NaHS明显减弱（P＜0.01），Runx2、BMP及OPN表达量明显增加。NaHS与Pia对CollaⅠ、OPN、Runx2和BMP表达的影响作用效果类似，导致成骨细胞分化及骨形成相关基因表达增加（图4）。

2.5 H2S对HG诱导的成骨细胞矿化减少有抑制作用，抑制作用与KATP通道无关

HG与对照组相比较，HG处理后的成骨细胞矿化量明显降低（P＜0.01），同时NaHS预处理对HG导致的成骨细胞矿化减少有抑制作用（P＜0.05）。然而Gli或Pia对成骨细胞矿化的影响不显著（P＞0.05），表明KATP通道与成骨细胞的矿化无关（图5）。

图5 H2S调节HG诱导的成骨细胞矿化Fig 5 H2S mediated HG-induced osteoblast mineralization

3 讨论

本研究证实外源性H2S对HG引起的成骨细胞功能损伤有预防作用。H2S预处理抑制HG诱导的成骨细胞增殖减少，与预期相符，也与H2S可以预防H2O2诱导的mc3t3-e1成骨样细胞损伤相一致[6]。KATP通道在许多细胞有表达并通过膜电位调节各种细胞的功能，KATP通道与人成骨样细胞MG-63增殖密切相关[7]。有研究[8]证实外源性H2S是血管平滑肌KATP通道的开关。本实验中HG组KATP表达明显降低，外源性H2S加入后，KATP表达明显增加，而单H2S处理不影响受体KATP的表达。这些结果表明KATP通道在HG条件下受阻，H2S的预处理使这种受阻得到解除。以前的研究[5,7]检测了H2S在细胞增殖中的作用，总结出H2S对细胞增殖的双重调控取决于细胞的类型。目前研究表明，H2S处理抑制HG诱导的成骨细胞增殖减少而单H2S处理对成骨细胞增殖无影响。用靶向H2S的KATP通道抑制剂处理，细胞的增殖能力减弱。因此，推测H2S作为KATP通道的开放剂，保持成骨细胞在HG条件下的增殖能力。此外，细胞增殖实验结果表明，外源性H2S能通过KATP通道明显防止HG对成骨细胞的增殖能力损伤。

最近H2S对破骨细胞和成骨细胞分化的影响有不同的报道[9-10]，认为H2S对不同细胞有不同的影响。通过分析H2S对成骨细胞的分化及骨形成相关基因表达的影响，结果表明，H2S可防止HG引起的成骨细胞分化相关基因表达的减少，实时定量RT-PCR表明HG组CollaⅠ、OPN、Runx2和BMP的mRNA显著降低，而H2S保护时下降不明显，这与以前的研究[11]一致。更重要的是，成骨细胞的成骨分化与KATP通道密切相关[12]。研究[13]结果表明，H2S与KATP通道开放剂Pia对Runx2和BMP的表达有类似的效果。这些结果表明H2S在HG诱导的成骨细胞分化过程中，其发挥保护作用可能是在转录阶段通过调节KATP通道调节来完成。然而这一推测，目前仍有待进一步的实验验证。

HG可通过抑制钙的摄取明显抑制成骨细胞的矿化[14]。实验结果进一步证实了笔者的假设，H2S可以防止HG诱导成骨细胞的矿化。此外，单一H2S并没有影响到成骨细胞的矿化，与Zavaczki等[11]对血管平滑肌细胞钙化的观察不一致。他们认为单一H2S抑制钙化。这种差异可能起源于细胞的不同类型和功能，在接下来的研究中还需进一步的阐明。

综上所述，这项研究的结果表明，外源性H2S促进成骨细胞增殖并通过开放KATP通道防止HG损伤成骨细胞。另外，H2S也防止HG引起成骨细胞矿化还原，但与KATP通道不相关。这些研究结果为H2S治疗糖尿病所致的骨质疏松提供了一定的理论依据。

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（本文编辑 杜冰）

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Role of adenosine triphosphate-sensitive potassium channel in hydrogen sulfide-induced inhibition of high glucose- induced osteoblast damage

Liu Yuanyuan1, Guan Xiumei2, Cheng Min2, Li Xin2, Pan Yueyang2, Guo Zhiliang3.
(1. Dept.of Stomatology, School of Stomatology, Affiliated Hospital of Weifang Medical University, Weifang 261053, China; 2. School of Clinical Medicine, Weifang Medical University, Weifang 261053, China; 3. Dept. of Spinal Surgery, PLA Eighty-ninth Hospital, Weifang 261053, China)
Supported by: National Natural Science Foundation of China (31570941, 31270993); Ministry of Education New Century Talent Program (NCET-10-0922); Research Project of Shandong Provincial Health Department (2016WS0684); Research Project of Shandong Provincial Education Department (J14LK12); Science and Technology Development Plan of Weifang(2016YX066); Public Funding for Teachers’ Visiting Projects in Weifang Medical University. Correspondence: Guo Zhiliang, E-mail: drzlguo@163.com.

Objective The aim of this study is to identify the role of adenosine triphosphate-sensitive potassium channel(KATP) in hydrogen sulfide (H2S)-induced inhibition of high glucose (HG)-induced osteoblast damage. Methods Osteoblasts from rat mandible were cultured and identified. The osteoblasts were then treated with HG, H2S, KATP channel opener pinacidil(Pia), and KATP channel blocker glibenclamide (Gli). Western blot method was performed to detect the expression of KATP channel protein. CCK8, reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) , and image analysis were used to determine the effects of H2S-KATP on the proliferation, differentiation, and mineralization of osteoblasts. Results The expression of KATP channel protein in osteoblasts was significantly decreased under the influence of HG. H2S pretreatment significantly inhibited HG on KATP channel protein down-regulation. Moreover, H2S pretreatment significantly inhibited the effect of HG on the proliferation of osteoblasts, thereby preventing HG-induced inhibition of osteoblasts differentiation and mineralization. Meanwhile, the KATP channel blocker effectively blocked the H2S on osteoblasts and had a protective effect. Conclusion Through the KATP channel,H2S inhibited osteoblasts damage induced by HG.

hydrogen sulfide; high glucose; osteoblast; adenosine triphosphate-sensitive potassium channel

R 783

A

10.7518/hxkq.2017.05.005

2017-05-13；

2017-07-26

国家自然科学基金（31570941，31270993）；教育部新世纪人才计划（NCET-10-0922）；山东省医药卫生科技计划（2016-WS0684）；山东省高等学校科技计划（J14LK12）；潍坊市科技发展计划（2016YX066）；潍坊医学院教师公派国内访学项目

刘媛媛，讲师，硕士，E-mail：liuyuan113@sina.com

郭志良，副教授，博士，E-mail：drzlguo@163.com