胡琳敏，杨霄旭，王 金，向双林，魏晨曦

(1. 湖南师范大学生命科学学院，动物多肽药物创制国家地方联合工程实验室，中国 长沙 410081；2. 湖南中医药大学医学院，中国 长沙 410208)

跨界基因沉默菌株的快速构建及对靶标基因干扰能力的检测

胡琳敏1#，杨霄旭1,2#，王 金1，向双林1，魏晨曦1

(1. 湖南师范大学生命科学学院，动物多肽药物创制国家地方联合工程实验室，中国 长沙 410081；2. 湖南中医药大学医学院，中国 长沙 410208)

“跨界基因沉默”是一种利用大肠杆菌在哺乳动物细胞中传递小干扰RNA并引起基因沉默的新颖技术，具有实用、稳定和低成本等优点.该技术通过构建一种能转录出短发夹RNA (shRNA) 的大肠杆菌，而这种大肠杆菌产生的shRNA能靶向哺乳动物细胞中的特定基因，从而引发RNA干扰(RNAi).本文用RecA同源重组的方法将跨界基因沉默质粒的工作元件快速地整合到大肠杆菌的染色体DNA上，构建了跨界基因沉默菌株.通过吖啶橙染色实验证明了跨界基因沉默菌株能够入侵哺乳动物细胞，最后Western blot结果表明跨界基因沉默菌株可以对靶标基因产生干扰作用.该技术的完善将进一步促进工程菌的研发和利用.

siRNA传递；跨界基因沉默菌株；RNA干扰；RecA同源重组

AbstractTrans-kingdom RNA interference (TkRNAi) is a useful, stable and low-cost approach for small interference RNA delivery, which employs the genetically engineeredE.colito produce short hairpin RNA and then deliver it into mammalian cells. The shRNA, transcribed by the genetically engineeredE.coli, can target and silence the particular gene expression in mammalian cells. We used RecA homologous recombination to quickly integrate working components of TkRNAi into the chromosome DNA of engineeredE.coli, thus yielding trans-kingdom interference bacteria. Acridine orange staining tests demonstrated that the trans-kingdom interference bacteria could invade into mammalian cells. Finally, western blot analysis results showed that the trans-kingdom interference bacteria could silence expression of target genes. The improvement of the TkRNAi technology will further promote the development and utilization of this kind of engineering bacteria.

KeywordssiRNA delivery; trans-kingdom RNAi bacteria; RNAi; RecA homologous recombination

RNA干扰(RNA interference, RNAi)是由小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)引起的细胞内序列特异性基因沉默，这给恶性肿瘤等疾病的治疗带来了新的希望[1].然而，siRNA的低血清稳定性、易脱靶性和易引起免疫反应等缺点，也给临床应用带来了很大的挑战[2].此外，鉴于siRNA自身的结构，导致其不能直接穿过细胞……