程英+胡颖+覃永华+程钢+王春台

摘要：通过生物信息学分析确定OsV3IP2和OsV3IP3的可溶性肽段，获得可溶性的OsV3IP2和OsV3IP3外源表达蛋白质，将相应的编码区克隆于原核表达载体pET32a中，进行IPTG诱导表达，利用SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白质。结果表明，利用生物信息学软件对蛋白质的二级结构进行预测，将OsV3IP2、OsV3IP3分别分为2个和4个部分。将其分别克隆到pET32a后，采用0.2 mol/L IPTG在10、20、30 ℃诱导表达。经SDS-PAGE和Western Blot分析，证明OsV3IP2-1、OsV3IP 2-2、OsV3IP 3-1表达的融合蛋白存在于上清液中，而OsV3IP 3-2、OsV3IP 3-3表达的融合蛋白存在于沉淀中，获得了OsV3IP2-1、OsV3IP 2-2、OsV3IP 3-1可溶性目的蛋白，为进一步体外验证OsVDAC3与OsV3IP2、OsV3IP3的互作奠定了基础。

关键词：水稻；OsV3IP2-3；诱导表达；SDS PAGE；Western Blot

中图分类号：S511；Q812 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）17-3349-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.17.041

Expressing and Identifying of OsV3IP2 and OsV3IP3 from

Rice in Bacterial Expression Vector

CHENG Ying， HU Ying， QIN Yong-hua， CHENG Gang， WANG Chun-tai

（South-Central University for Nationalities/Hubei provincial Key Laboratory for Protection and Application of Special Plants in Wuling Area of China， Wuhan 430074，China）

Abstract： The bioinformatic analysis was used to identify soluble fragments of OsV3IP2 and OsV3IP3，and soluble OsV3IP2 and OsV3IP3 proteins in bacterial expression systemo were btained. The corresponding coding sequences of different fragments were cloned into bacterial expression vector pET32a. The target peptides were expressed via IPTG induction，and detected by SDS-PAGE and Western blot. Result showed that from the predicted secondary structures，we identified 2 soluble fragments from OsV3IP2 and 4 soluble fragments from OsV3IP3. The expression of recombinant peptides in bacteria was induced in the presence of 0.2 mol/L IPTG at 10，20，or 30 ℃.As shown by SDS-PAGE and Western Blot analysis，OsV3IP2-1，OsV3IP2-2，and OsV3IP3-1 are in the soluble fraction of bacterial lysate，while OsV3IP3-2 and OsV3IP3-3 stay in the precipitation. We have obtained soluble peptides OsV3IP2-1，OsV3IP2-2，and OsV3IP3-1，which laid the foundation for future in vitro studies on protein-protein interactions between OsVDAC3 and OsV3IP2 or OsV3IP3.

Key words： rice；OsV3IP2-3；induced expression；SDS PAGE；western Blot

VDAC是存在于線粒体外膜上的孔道蛋白，能在膜上形成亲水性电压门控通道，是线粒体外膜主要的运输蛋白[1]。VDAC蛋白广泛存在于真菌到动植物的生物体中，依赖电压调节其对阴阳离子的选择性[2，3]。相对于动物和真菌，植物中具有较多的VDAC异构体，说明VDAC可能在植物中具有更多的特殊功能[4]。从生物中分离得到VDAC基因时发现含有多种异构体[4]，酵母只有1种VDAC，人类、鼠、兔等均有3种VDAC，模式植物拟南芥有4种，然而水稻中有8种VDAC[5]。VDAC不同亚型影响着不同的生理功能。胡颖等[6]发现YTB超表达OsVDAC3对水稻的耐盐性和耐旱性有一定的敏感性。通过基因枪法进行亚细胞定位发现，OsVDAC3蛋白在细胞核、细胞质膜和分泌小泡上均有定位，且信号肽定位在N端[7]。另外，熊杰[8]和刘洋[9]对OsVDAC3也进行了原核和真核表达分析。武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室前期构建了水稻膜系统酵母双杂交cDNA文库，并从该文库中筛选得到了3个与OsVDAC3互作的蛋白质[6]，将其命名为OsV3IP1-3。对这3个互作蛋白质功能和亚细胞定位进行了预测。但它们是否真的同OsVDAC3发生了相互作用还需要进一步验证。由于预测的OsV3IP1-3均为膜蛋白质，本研究通过生物信息学分析，将OsV3IP2、OsV3IP3分为不同结构域分别进行外源诱导表达，获得可溶性肽段，为进一步验证它们与OsVDAC3的互作提供基础。endprint

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 原核表达载体pET28a、pET-32a、pGEX-6P-1，大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）与DH5α均由武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室提供。

1.1.2 试验试剂 限制性内切酶QuickCutTM BamH I、QuickCutTM Xho I，T4-DNA连接酶，Ex Taq酶，DL15000和DL2000 DNA Marker均购自Takara公司。DNA凝胶回收和清洁试剂盒均购自Axygen公司。Page RulerTM Prestained Protein Ladder购自Thermo公司。His Tag Mouse Monoclonal Antibody及二抗羊抗鼠购自Abbkine公司。超敏ECL化学发光即用型底物购自武汉博士德生物工程有限公司。引物合成及测序均由昆泰锐生物科技有限公司完成。

1.1.3 试验仪器 C1000 Touch Thermal Cycler型PCR仪和凝胶成像分析仪，购自美国Bio-RAD公司；752N型紫外可见分光光度计，购自上海精科公司；Centrifuge 5415D、5417R和5810R离心机，购自德国Eppendoff公司；CR22G高速离心机，购自日本Hitachi公司；Soniprep 150型超声破碎仪，购自日本SANYO公司；半干式碳板转移电泳槽、DYY-5型稳压稳流电泳仪和胶片观察灯，购自北京六一仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 OsVDAC3及OsV3IP1-3结构分析 利用生物信息学软件InterProScan软件（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search）对OsVDAC3及OsV3IP1-3蛋白质的序列和结构进行分析，根据不同的结构域将蛋白质进行拆分，分结构域进行蛋白质诱导及互作验证。

1.2.2 原核表达载体的构建 根据OsVDAC3和OsV3IP1-3基因序列，设计正向和反向引物，并添加对应的酶切位点。所有引物及序列如表1所示。

采用20 μL体系进行PCR反应：15.3 μL dd H2O， 2 μL 10 ×Ex Taq Buffer，1 μL dNTP（2.5 mmol/L），0.3 μL 引物F（10 mmol/L），0.3 μL 引物R（10 mmol/L），1 μL pET-32a-OsV3IPs质粒DNA，0.1 μL Ex Taq 酶。PCR反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性 30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，重复 34 个循环；72 ℃延伸5 min。PCR扩增反应完成后使用Axy Prep DNA清洁试剂盒对PCR产物进行清洁回收，详细操作参考试剂盒说明书，并进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。用限制性内切酶BamH I和 XhoⅠ双酶切目的片段和pET-32a空载体，37 ℃酶切3～4 h，使用Axy Prep DNA凝胶回收试剂盒对酶切产物进行切胶回收。用T4连接酶连接双酶切后的目的基因和pET-32a载体，16 ℃连接过夜并转化DH5α感受态细胞，涂LB（含Amp+）平板，37 ℃倒置培养过夜。挑取单克隆，采用碱裂解法提取质粒，进行PCR扩增和酶切鉴定，将对应阳性克隆菌液送昆泰锐生物科技有限公司进行序列测定。

1.2.3 融合蛋白诱导表达 将重组质粒和pET-32a空载体转化BL21（DE3）表达菌株，涂LB（含Amp+）平板，37 ℃倒置培养过夜。分别挑取单克隆于3 mL含Amp+的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养过夜，第二天按1∶100的比例（V/V）接种于5 mL含Amp+的LB液体培养基中，37 ℃，180 r/min 振荡培养至 OD600 nm为0.6左右，将1 mol/L IPTG稀释到合适的终浓度。以不加IPTG的重组载体和加IPTG的pGEX-6p-1、pET-32a、pET-28a空载体的BL21菌株作为阴性对照。设置IPTG浓度梯度、诱导时间梯度、诱导温度梯度来分析最适表达条件。

1.2.4 融合蛋白的SDS-PAGE检测 将诱导表达的菌液转入10 mL离心管中，4 ℃，4 000 r/min离心20 min，向菌体沉淀中加入适量的PBS buffer重悬菌体，用移液枪反复吹打混匀。在烧杯中装入碎冰，将重悬菌体固定其中，进行超声波破碎（破碎10 s，间歇10 s），观察液体变澄清即可。4 ℃，8 000 r/min離心20 min，收集蛋白质上清液和沉淀，分别处理。向沉淀中加入适量的蛋白质沉淀变性液，用移液枪吹打混匀，室温放置约1 h，每隔15 min混匀一次，4 ℃，12 000 r/min离心15 min，收集上清液，此时的上清液即为沉淀液。将变性蛋白质样品和适量的SDS-PAGE loading buffer混合均匀后瞬时离心，并在沸水中煮沸10 min变性，放置于冰上冷却，再次离心，作为上样产物。60 V恒压电泳，待指示带电泳至玻璃板最低端时停止电泳，进行考马斯亮蓝染色或Western检测。

1.2.5 融合蛋白的Western检测 半干式转膜仪80 mA恒流转膜2.5 h后，加入40 mL蛋白封闭液室温封闭1.0 h，按1∶5 000的比例（V/V）向封闭液中加入His抗体，4 ℃振荡过夜，第二天按1∶10 000的比例（V/V）向封闭液中加入二抗羊抗鼠，孵育箱内 25 ℃振荡孵育1.5 h后进行ECL化学发光检测。

2 结果与分析

2.1 OsV3IP1-3序列分析

前期试验发现pET-32a-OsV3IP2以及pET-28a-OsV3IP1、pET-28a-OsV3IP3在体外表达不明显，所以利用生物信息学软件对蛋白质的二级结构进行预测，根据InterProScan软件分析蛋白质的结构。OsV3IP2分为2个部分（图1），OsV3IP2-1包含第46～76个氨基酸、OsV3IP2-2包含第46～76个氨基酸。OsV3IP3分为4个部分（图2），OsV3IP3-1包含第315～399个氨基酸、OsV3IP3-2包含第414～623个氨基酸、OsV3IP3-3包含第30～304个氨基酸、OsV3IP3-4包含第22～624个氨基酸。endprint

2.2 原核表达载体的构建

分别以 pET-32a-OsV3IP2-3为模板扩增目的片段，与pET32a连接后构建原核表达载体。从转化的平板上随机挑取单克隆进行扩大培养提取质粒，然后对重组质粒进行PCR检测。结果显示，OsV3IP1-3的PCR产物与预期的片段大小相符（图3）。选取大小符合的样品进行DNA序列测定，序列比對结果表明pET32a重组表达载体构建成功。

2.3 融合蛋白质诱导表达及Western blot检测

将阳性重组质粒热激转化BL21表达菌株，分别加入不同浓度的IPTG后，于不同温度条件下振荡培养诱导蛋白质表达，在诱导不同时间段取样8 mL，从而检测诱导温度、诱导IPTG浓度和诱导时间对蛋白质表达的影响。同时，以不加IPTG的pET-32a空载体的BL21菌株作为阴性对照。在诱导温度为20、30 ℃，IPTG浓度为0.2 mmol/L条件下，pET32a-OsV3IP2-1、pET32a-OsV3IP 2-2、pET32a-OsV3IP 3-1表达的融合蛋白质存在于上清液中，而pET32a-OsV3IP 3-2、pET32a-OsV3IP 3-3表达的融合蛋白质存在于沉淀中（图4），这一结果进一步通过His抗体的Western Blot分析证明。

3 小结与讨论

大肠杆菌表达系统是目前表达外源蛋白质的首选，利用该表达系统表达重组蛋白质有许多优越性，但表达的外源蛋白质容易被宿主蛋白酶攻击或未能正确折叠形成包涵体，其表达受到了限制[10]。当外源蛋白质在大肠杆菌中表达时，有些蛋白质会在细胞质中形成不溶性的包涵体，颗粒直径50～500 nm不等[11]，将靶蛋白质融合在某些易于表达和纯化的“融合标签”的N末端或C末端可提高蛋白质的高效可溶性表达。本试验利用生物信息学软件对蛋白质的二级结构进行预测，根据InterProScan软件分析蛋白质的结构，将OsV3IP2、OsV3IP23分别分成2个和4个部分分别进行体外表达，在优化条件下获得了可溶性目的蛋白质OsV3IP2-1、OsV3IP 2-2、OsV3IP 3-1，这些结果为体外进一步验证OsVDAC3与OsV3IP2、OsV3IP3的互作奠定了基础。

参考文献：

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[9] 刘 洋.OsVDAC3和OsVDAC5蛋白的原核表达及表达模式的初步分析[D].武汉：中南民族大学，2014.

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