黄 芬 曾江正 卢彦达 洪 涛 何志惠 雷俊华

(海南医学院第一附属医院肿瘤内科 海南医学院第一附属医院肿瘤学部，海南 海口 571100)

miR-374b靶向PD-1/PD-L1信号通路增强CIK杀伤肿瘤细胞效应

黄 芬 曾江正 卢彦达 洪 涛 何志惠 雷俊华

(海南医学院第一附属医院肿瘤内科 海南医学院第一附属医院肿瘤学部，海南 海口 571100)

目的探讨miR-374b在增强细胞因子诱导杀细胞(CIK)抗肿瘤中的作用及机制。方法采用传统方法培养CIK，用流式细胞确定CIK细胞群且分选出CIK；流式分析HepG2、PLC、H1299、A549的程序性坏死蛋白(PD)-L1表达；采用双荧光素酶系统检测miR-374b在PD-1上的结合，siRNA技术干扰降低miR-374b基因的表达；酶联免疫吸附(ELISA)检测CIK的γ干扰素(IFN-γ)表达；乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CIK体外杀伤肿瘤细胞的能力；过继回输检测CIK体内杀伤肿瘤细胞的能力。结果双荧光素酶系统显示miR-374b可以直接作用于PD-1基因上；HepG2、PLC、H1299、A549肿瘤细胞系都有比较高的PD-L1表达；miR-374b抑制剂会降低CIK分泌IFNr的水平，抑制CIK在体内和体外对肿瘤细胞的杀伤能力；PD-1 siRNA会提高CIK分泌IFN-γ的水平，增强CIK在体内和体外对肿瘤细胞的杀伤能力。结论miR-374b可以直接作用于PD-1基因的表达，抑制miR-374b可以增强CIK杀伤肿瘤能力，干扰PD-1表达可以提高CIK抑制肿瘤能力。

细胞因子诱导杀伤细胞;PD-1/PD-L1;流式细胞术

细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)是新一代肿瘤过继免疫治疗的首选方案。程序性死亡蛋白(PD)-1可表达于B细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突细胞(DC)，还有活化的单核细胞。其主要表达于活化的T细胞表面，与其配体相互作用，抑制外周组织中的持续免疫反应，并且阻止自身组织受到免疫损伤〔1〕。PD-1 的配体包括 PD-L1 和 PD-L2，主要在巨噬细胞、单核细胞中表达。肿瘤细胞上的PD-L1与T细胞表面的PD-1相互作用，可以诱导对抗肿瘤的T细胞凋亡，从而产生免疫逃逸〔2〕。miR-374b在对抗肿瘤中具有重要作用〔3〕。CIK对抗肿瘤细胞可能通过miR374b调控PD-1/PD-L1信号通路来进行。本文拟对此进行分析。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 T细胞培养基：RPMI-1640培养基，10%FBS(Gibco 900-108)，青霉素/链霉素溶液(Gibco 15140-122)，2-巯基乙醇(Invitrogen 21985-023)。流式荧光抗体：购于Biolegend公司。IFN-γ的ELISA检测试剂盒购自eBioscience公司。SYBR Green：takara公司。流式仪器：calibur，BD LSRFortessa；分选仪器：BDFACSAria Ⅱ。

1.2CIK 的诱导和培养 将来源于健康志愿者的外周血用淋巴细胞分离液(Ficoll)采用密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞。在48孔板中，每孔种植5×106，加入1 ml RPMI1640培养置于 37℃、5% CO2培养箱中培养 2 h。收集非贴壁细胞调整细胞浓度为 1×106/孔，并加入1 000 U/ml γ-干扰素(IFN-γ)继续培养，24 h后加入50 ng/ml抗人CD3 及1 000 U/ml白细胞介素(IL)-2，每3天换液1次，并补充IL-2。在培养14、21、28 d收集细胞并进行免疫表型CD3+CD56+的检测。

1.3细胞介导的细胞毒作用 采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测。特异性杀伤活性的计算：杀伤活性(%)=〔(OD实验组-OD总自然释放)/(OD最大释放组-OD总自然释放)〕×100%。

1.4细胞因子刺激 将分离得到的细胞在1 ml T细胞培养基中，加入25 ng/ml PMA和1 μg/ml离子霉素并孵0.5 h。再加 2 μmol/L莫能菌素继续孵育4～5 h。

1.4.1流式抗体标记 (1)表面抗体标记：将细胞重悬在100 μl磷酸盐缓冲液(PBS)中，按照1×106细胞标1 μl流式抗体。置于冰中避光孵育30 min，再加2 ml PBS洗1～2次。(2)胞质细胞因子与核内转录因子标记：购买Ebioscience公司胞质与核固定液，按照说明书进行固定标记。

1.4.2RT-PCR检测 将分离得到的细胞提取RNA，反转录成cDNA，用SYBR Green 进行荧光定量PCR检测。

1.5过继回输实验 取40只患黑色素瘤鼠的肿瘤组织8 mm3，皮下移植到免疫缺陷的NOD/SCID鼠体内，分成4组，每组10只。肿瘤移植1 w后，一组尾静脉注射PBS作为对照，一组尾静脉注射培养的人CIK，一组尾静脉注射加了miR374b抑制剂培养的人CIK，一组尾静脉注射了加PD-1 siRNA的人CIK。细胞数为1×107/只，每周注射一次，连续6 w。观察记录小鼠的存活情况。

1.6统计学方法 采用SPSS17.0软件行单因素方差分析。

2 结 果

2.1培养、分离及鉴定CIK(CD3+CD56+T) 在第14天，同时表达CD3+CD56+的CIK比例达到最大(图1)。由图2可见，使用PD-1 siRNA作用于CIK后，从mRNA和Western印迹结果都显示，CIK的PD-1表达明显降低。

图1 流式细胞术分析与分选CIK细胞

图2 RT-PCR与Western印迹检测PD-1 siRNA抑制CIK细胞的PD-1表达

2.2双荧光素酶系统检测及验证miR-374与PD-1的靶向关系 连接了miR374b的荧光活性低于PGL3质粒空载(P<0.05)。见图3。2.3流式细胞仪分析HepG2、PLC、H1299、A549的PD-L1表达情况 PD-L1 在HepG2、PLC、H1299、A549 4种细胞系里都有比较高的表达，其在肺癌细胞株H1299中表达最高，在A549细胞系中表达相对最低(P<0.01)。见图4。

2.4CIK分泌IFN-γ能力的测定 加入miR374b抑制剂的CIK，相比没有处理组的，其分泌IFN-γ的能力显著下降(P<0.01)，而如果转入能降低PD-1表达的PD-1 siRNA后，，其分泌IFN-γ能力显著上升(P<0.001)。见图5。

图3 双荧光素酶系统检测miR-374与PD-1的靶向关系

图4 流式细胞仪分析HepG2、PLC、H1299、A549的PD-L1表达

图5 ELISA检测CIK细胞分泌IFN-γ水平

2.5LDH释放法检测CIK细胞杀伤肿瘤细胞的能力 正常情况下，CIK对4种肿瘤细胞具有良好的杀伤效率。而加入了miR374b抑制剂，CIK对肿瘤细胞杀伤能力明显减弱。同时采用siRNA将CIK上的PD-1表达降低后，CIK杀伤肿瘤细胞能力又有进一步提高(P<0.05)。见图6。

A：HopG2 24 h;B:HopG2 48 h;C:PLC 24 h;D:PLC 48 h;E:H1299 24 h;F:H1299 48 h;G:A549 24 h;H:A549 48 h;1)P<0.05,2)P<0.01图6 LDH释放法检测CIK细胞体外抗肿瘤能力

2.6CIK过继回输检测体内杀伤肿瘤细胞 过继回输了CIK的小鼠，其存活率明显高于没有过继回输CIK的小鼠。在培养CIK过程中，加入了miR374b抑制剂的CIK抗肿瘤效果明显降低，加入PD-1 siRNA的CIK抗肿瘤能力显著升高(P<0.01)。见图7。

图7 过继回输检测CIK细胞体内抗肿瘤能力

3 讨 论

CIK在治疗肿瘤中疗效显著，特别是CIK不会被控制免疫力的药物所抑制，临床试验治疗也发现CIK在治疗肿瘤病人中具有安全性和有效性〔4〕。采用CIK的免疫治疗，通过刺激免疫系统及增加抗肿瘤能力，可以克服化疗所带来的药物耐受〔5〕。同时在动物实验中，在将人的淋巴瘤细胞打入免疫缺陷小鼠体内后，输入CIK可以明显延长小鼠的存活时间〔6〕。本研究也说明CIK对肿瘤确实有比较好的治疗效果。PD-1/PD-L1信号通路在抗肿瘤的研究中发挥着重要作用。研究发现，PD-1/PD-L1信号通路参与了肿瘤的免疫逃逸，表达PD-L1的肿瘤细胞抵抗T细胞抗肿瘤的能力增强，同时增强其侵袭能力，而如果采用PD-L1阻断抗体，这种能力被逆转〔7〕。而在PD-1缺失的小鼠中，其体内肿瘤细胞生长受到了抑制，并且在肿瘤小鼠模型中采用抗PD-1，PD-L1抗体，可以显著提高小鼠生存率〔8〕。本研究结果提示肿瘤细胞表达PD-L1与T细胞上的PD-1结合后，有助于肿瘤细胞的免疫逃逸。

miRNA通过结合mRNA，在基因的转录后调控中发挥着重要作用。研究发现，miRNAs 跟MAPK信号通路的超活化相关，在PC-3前列腺癌细胞中过表达miR-374b可以降低血管内皮生长因子(VEGF)-A的表达，miR-374b 可以结合到VEGF-A，从而抑制骨肉瘤细胞的血管形成〔9〕。本研究结果表明miR-374b参与了PD-1/PD-L1信号通路，通过降低CIK上PD-1表达，解除了肿瘤细胞通过PD-L1对表达PD-1T细胞的免疫抑制作用，从而提高CIK对肿瘤细胞的杀伤作用。

1Boussiotis VA,Chatterjee P,Li L.Biochemical signaling of PD-1 on T cells and its functional implications〔J〕.Cancer J，2014;20(4):265-71.

2Benson DM Jr,Bakan CE,Mishra A,etal.The PD-1/PD-L1 axis modulates the natural killer cell versus multiple myeloma effect:a therapeutic target for CT-011,a novel monoclonal anti-PD-1 antibody〔J〕.Blood，2010;116(13):2286-94.

3Xie J,Tan ZH,Tang X,etal.miR-374b-5p suppresses RECK expression and promotes gastric cancer cell invasion and metastasis〔J〕.World J Gastroenterol,2014;20(46):17439.

4Jiang JT,Shen YP,Wu CP,etal.Increasing the frequency of CIK cells adoptive immunotherapy may decrease risk of death in gastric cancer patients〔J〕.World J Gastroenterol,2010;16(48):6155-62.

5Liu P,Chen L,Huang X.The antitumor effects of CIK cells combined with docetaxel against drug-resistant lung adenocarcinoma cell line SPC-A1/DTX in vitro and in vivo〔J〕.Cancer Biother Radiopharm,2009;24(1):91-8.

6Yun YS,Hargrove ME,Ting CC.In vivo antitumor activity of anti-CD3 induced activated killer cells〔J〕.Cancer Res,1989;49(17):4770-4.

7Spranger S,Koblish HK,Horton B,etal.Mechanism of tumor rejection with doublets of CTLA-4,PD-1/PD-L1,or IDO blockade involves restored IL-2 production and proliferation of CD8(+) T cells directly within the tumor microenvironment〔J〕.J Immunother Cancer，2014;2(1):3.

8Iwai Y,Terawaki S,Honjo T.PD-1 blockade inhibits hematogenous spread of poorly immunogenic tumor cells by enhanced recruitment of effector T cells〔J〕.Int Immunol,2005;17(2):133-44.

9Miller PC,Clarke J,Koru-Sengul T,etal.A novel MAPK-microRNA signature is predictive of hormone-therapy resistance and poor outcome in ER-positive breast cancer〔J〕.Clin Cancer Res,2015;21(2):373-85.

〔2017-03-11修回〕

(编辑 袁左鸣)

R3

A

1005-9202(2017)19-4724-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.015

2016海南省科技项目资助(No.ZDYF2016107)

曾江正(1978-)，男，硕士，主要从事肿瘤化疗及生物免疫治疗研究。

黄 芬(1980-)，女，硕士，副主任医师，主要从事实体肿瘤的生物免疫治疗研究。