林颖峥，林士佳，张冠楠，李树清，熊 炜，郭雨雁，严亚贤

（1.上海交通大学，上海 200240；2.上海出入境检验检疫局，上海 200135）

野兔热快速检测方法的建立

林颖峥1，林士佳2，张冠楠2，李树清2，熊 炜2，郭雨雁2，严亚贤1

（1.上海交通大学，上海 200240；2.上海出入境检验检疫局，上海 200135）

野兔热是由土拉弗朗西斯菌引起的兔的一种高度接触性、致死性传染病。为加强口岸对进境野生及实验用兔中野兔热的筛查和流行病学调查，基于土拉弗朗西斯菌保守基因序列，建立了PCR和实时PCR检测野兔热的方法。将建立的方法应用于临床样品检测发现经PCR检测，仅有土拉弗朗西斯菌DNA出现条带单一的特异性基因扩增，经实时PCR检测，土拉弗朗西斯菌DNA在10～12个循环处出现显著扩增，对照病毒样品未见扩增；PCR检测土拉弗朗西斯菌DNA模板的下限量为100～10 pg，而实时PCR检测的下限量为100～10 fg。检测结果证实两种检测方法具有良好的特异性、灵敏性和稳定性，适合应用于野兔热的快速检测。

野兔热；PCR；Real-time PCR；Taqman探针

Abstract：Tularemia is a highly contagious and lethal disease caused by Francisella tularensis. In order to investigate the epidemic character of Tularemia transmission among wild and experimental rabbits，methods of PCR and Real-time PCR to detect Tularemia were established，based on the conserved sequence of Francis tularensis strains. Both methods were applied to test clinical samples. By PCR detection，only Francis tularensis single band DNA showed bacteria specific gene amplification. By real-time PCR detection，tularemia bacteria DNA in 10-12 cycles Francis appeared significant amplification，and no amplification was found in the control virus samples. The lower limit of the amount of CR detected DNA template for tularemia bacteria Francis was 100-10 pg，and the lower limit of real-time PCR detection was 100-10 fg. The results showed that PCR and Real-time PCR methods were specific，sensitive and reproducible，thus both methods were suitable for Tularemia rapid detection.

Keywords：Tularemia；PCR；real-time PCR；taqMan probe

野兔热（Tularaemia）又称兔热病、土拉热、土拉杆菌病、土拉弗氏菌病，是由土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）感染引起的一种急性人兽共患传染病。1912年，McCoy从美国土拉县的黄鼠中分离出该菌，并根据该地名将其命名为土拉菌。1919年，美国华盛顿公共卫生官员Francis被派到犹他州调查鹿蝇热病期间，对该菌做了大量的研究工作。鉴于其贡献，将该菌重命名为土拉弗朗西斯菌。根据菌株对家兔的毒力和能否分解甘油，将全世界已知菌株分为3个地理变种：美洲变种，能分解甘油，毒力最强；欧亚变种，大多不分解甘油，毒力较弱；中亚变种，能分解甘油，但毒力弱。该病以体温升高、皮肤溃疡、肝脾坏死、淋巴结肿大、呼吸道和消化道炎症为主要特征，主要通过排泄物污染的饲草、饮水、用具及吸血节肢动物等媒介传播，一般在夏季多发[1-7]。

野兔热多数发生在北半球国家，流行于北纬30º～71º 地区。我国于1957年在内蒙古通辽地区首次发现野兔热病例，并从病人和死亡黄鼠体内分离到本病病原体[8]；1959年，我国第1例人野兔热病例在黑龙江省被报道[9]；1983年，相继在青海、西藏、新疆等地，分别从人、野兔、硬蜱中分离出该菌[10-11]；1986年，山东省胶南县某野兔肉加工厂暴发野兔热疫情，10 d之内发病31人；1992年，从西藏地区银盾革蜱中发现10多株土拉弗朗西斯菌。199l—1993年，刘增加等[12]在甘肃省西部祁连山和南部迭部林区发现人群中存在野兔热的隐性感染，血清阳性率分别为9.8%、10.3%。之后我国其他地区陆续发现存在土拉弗朗西斯菌感染和其自然疫源地。近几年，该病在我国报道较少，在世界其他地区也以散发为主，但有小规模的暴发流行。

鉴于野兔热危害较大，我国将其列为二类动物疫病。目前检测野兔热的方法主要有血象检查、皮内试验、病原分离鉴定、免疫荧光抗体试验、血清凝集试验、酶联免疫吸附试验等。由于受试样本的局限性，且传统检测方法存在操作繁琐、耗时较长、灵敏度较低等问题[13-15]。为了加强口岸对进境野生及实验用兔的野兔热筛查和流行病学调查，本研究建立了PCR和实时PCR快速高通量检测方法，并对所建立核酸检测方法的特异性和灵敏性进行了评估。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

TRIzol购自Invitrogen公司；DNA提取试剂盒购自QIAGEN公司；Taq酶、AMV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP、随机引物、DNA Marker（DL2000）购自TaKaRa公司。

1.2 阳性样品来源及处理

本研究使用的土拉弗朗西斯菌菌株（AFTC410062）由上海出入境检验检疫局保存；其他兔病对照病毒由上海实验动物研究中心保存。根据样品核酸性质，分别进行核酸分离，提取制备成DNA或cDNA模板备用。

1.3 PCR检测

基于土拉弗朗西斯菌保守基因序列设计PCR引物，扩增基因片段大小为663 bp。上游引物：5´-ATC AGA AGG AAC ACC AAT GGC GAA G-3´；下游引物：5´-GTA TTC TGA CCT GCG ATT ACT AGC GA-3´。在PCR薄壁管中，加模板2 μL、10×Taq 酶浓缩缓冲液 2.5 μL、dNTP 0.5 μL、上下游引物各0.25 μL、Taq酶0.25 μL，加水补足至总体积25 μL。将PCR管置PCR仪上，按如下程序扩增：首先94 ℃预变性3 min；然后94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸 40 s，35个循环；最后72 ℃延伸3 min。将PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统拍摄。

1.4 实时PCR引物和TaqMan探针

基于土拉弗朗西斯菌保守基因序列，用Primer Express软件设计实时PCR引物和TaqMan探针。上游引物：5´-GCA TGT GGT TTA ATT CGA TGC A-3´；下游引物：5´-GAA AGT TCG CAG GAT GTC AAG A-3´；TaqMan 探 针：FAM 5´-CGC GAA GAA CCT TAC-3´MGB。

1.5 实时PCR检测

采用ABI公司ViiA7荧光PCR仪。反应体系：dNTP 0.5 μL、Taq 酶 0.25 μL、10×Taq 酶 浓缩缓冲液 2.5 μL、上下游引物各 0.25 μL、模板 1 μL、TaqMan探针0.25 μL，加水补足至总体积25 μL。反应条件：首先95 ℃预变性3 min；然后95 ℃ 15 s，58 ℃ 45 s，40个循环。在每个循环第2步收集荧光信号。

2 结果

2.1 PCR和实时PCR检测野兔热的特异性

基于土拉弗朗西斯菌保守基因序列，设计引物和探针，分别建立PCR和实时PCR检测方法，并使用不同兔病病毒（兔病毒性出血症病、兔痘病、兔纤维瘤病、兔粘液瘤病、兔水疱性口炎病）作为对照，测试这两种检测方法的特异性。结果显示：经PCR检测，仅有土拉弗朗西斯菌DNA出现条带单一的特异性基因扩增，其他对照样品均呈阴性（图1）；经实时PCR检测，土拉弗朗西斯菌DNA在10～12个循环处出现显著扩增，对照病毒样品未见扩增（图2）。

图1 常规PCR特异性检测

图2 实时PCR特异性检测

2.2 PCR和实时PCR检测野兔热的灵敏性

为测试所建立的PCR和实时PCR方法的灵敏性，将土拉弗朗西斯菌DNA进行定量并梯度稀释，制备浓度分别为 10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL 的模板，再分别用建立的两种方法进行检测。结果显示，PCR检测土拉弗朗西斯菌DNA模板的下限量为100 ～ 10 pg（图3），而实时PCR检测土拉弗朗西斯菌DNA模板的下限量为100～10 fg（图4）。

3 讨论

野兔热是兔的主要疫病之一，危害严重，一旦感染较难从兔群中清除，从而影响实验动物质量，干扰实验结果，是实验动物养殖和使用中重点防范的疫病。数十年来，学者们对土拉弗朗西斯菌的病原学特性和诊断方法进行了深入研究。将感染动物病料进行病原分离鉴定，是诊断野兔热最传统、最经典的方法。但土拉弗朗西斯菌对营养需求较高，生长速度缓慢，菌体偏小，分离困难，耗时较长，而且容易引起实验室感染。也可用抗表面抗原特异性荧光抗体检测病料或血液涂片，但其灵敏性和特异性不甚理想，且抗体通常在10 d左右才能达到诊断水平，检测特异性抗体的方法同样需要在2周之后才能使用。血清凝集试验和酶联免疫吸附试验是检测野兔热常用的血清学方法，其敏感性高、操作简便，但仅能检测血清样本，无法直接检测体液和动物组织样本，无法进行野兔热的早期诊断[16-20]。

图3 常规PCR敏感性检测

图4 实时PCR敏感性检测

为了满足口岸对大量野生、实验用兔及兔产品入境快速检疫的需要，本研究基于土拉弗朗西斯菌基因保守序列，建立了PCR和实时PCR快速核酸检测方法，证实PCR方法能有效扩增土拉弗朗西斯菌的特异性基因片段，实时PCR方法检测阴性和阳性样品荧光信号区分显著。将两种检测方法的灵敏性进行对比，证实实时PCR方法的检测下限比PCR方法提高了3个数量级。此外，与PCR方法相比，实时PCR方法操作更简便，检测周期更短，适合用于野兔热的快速高通量筛检。由于野兔热隐性感染率较高，采用灵敏度高的检测方法有助于提高隐性感染的检出率，可以做到早发现、早隔离，从而帮助实现尽可能降低损失、控制野兔热传入及传播的目的。

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（责任编辑：朱迪国）

Establishment of Rapid Detection Methods for Tularemia

Lin Yingzheng1，Lin Shijia2，Zhang Guannan2，Li Shuqing2，Xiong Wei2，Guo Yuyan2，Yan Yaxian1
（1. Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240；2. Shanghai Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai 200135）

S852.65

B

1005-944X（2017）10-0094-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.10.025

国家重点研发计划项目（2016YFC1202000、2016YFC1202004）；上海出入境检验检疫局科研专项（编号HK001-2014）